هلام الكهربائي هي تقنية معملية شائعة الاستخدام مع العديد من التطبيقات العملية بما في ذلك بصمات الحمض النووي وتسلسل الجينوم. تتضمن العملية الفصل الحمض النووي شظايا باستخدام تيار كهربائي أثناء تتبع معدل الحركة الجزيئية من خلال هلام الترشيح.
تتيح لك إضافة صبغة تتبع زرقاء أو برتقالية إلى عينات الحمض النووي عديمة اللون رؤية عينتك والحصول على معلومات حول كيفية تحرك جزيئات الحمض النووي أثناء الرحلان الكهربائي. يعتمد تحديد الهوية على حجم نطاقات الحمض النووي الموجودة على الهلام بعد هجرة الجزيئات.
كيف يعمل الهلام الكهربائي
هلام الكهربائي يسحب شظايا الحمض النووي عبر مادة هلامية باستخدام تيار كهربائي لعزل وتحديد جزيئات الحمض النووي حسب الحجم والشحنة الكهربائية. غالبًا ما يتم صنع الجل من مسحوق الاغاروز - عديد السكاريد المستخرج من الأعشاب البحرية.
يضاف Agarose إلى محلول منظم من الماء والملح ، ويتم تسخين الخليط وتبريده لصنع هلام مسامي يعمل كمصفوفة ترشيح أثناء إجراء الفصل الكهربائي. يتم بعد ذلك وضع الجل في وحدة رحلان كهربائي ومغطى بمحلول عازل موصل كهرباء.
يتم حقن المحاليل التي تحتوي على الحمض النووي وأصباغ التحميل في آبار صغيرة في الجل والتي يجب صنعها أثناء تحضير الهلام.
الأصباغاساعدكانظر بوضوح العينة التي تضيفها إلى آبار الهلام الموجودة بالقرب من القطب السالب لوحدة الرحلان الكهربي.يوجد قطب كهربائي موجب في الطرف المقابل. يتم وضع معيار معروف لشظايا الحمض النووي في البئر الأول الذي سيخلق سلمًا من نطاقات الحمض النووي لأغراض المقارنة وتحديد الهوية.
يعطي العمود الفقري للفوسفات في جزيئات الحمض النووي DNA شحنة سالبة. تجذب الأضداد ، وبالتالي ، تنجذب جزيئات الحمض النووي إلى القطب الموجب وتبدأ في التحرك ، أو "الهجرة" ، عند تشغيل تيار كهربائي.
تنتقل شظايا الحمض النووي الأصغر حجمًا أسرع من الأجزاء الكبيرة لأنها تواجه مقاومة أقل أثناء انتقالها عبر مصفوفة الهلام المسامية. تشكل شظايا الحمض النووي ذات الحجم المتماثل حزمًا من الحمض النووي في الهلام.
غرض صبغ التحميل وأهميته
الحمض النووي عديم اللون ، مضيفا تتبع الأصباغ لعينة تساعدك تحديد معدل الحركة من جزيئات بروتين مختلفة الحجم في الهلام أثناء الرحلان الكهربائي. تتضمن أمثلة صبغات التحميل التي تتحرك مع عينة الحمض النووي بروموفينولأزرق و زيلين سيانول.
يجب ألا تكون الصبغة المختارة تفاعلية أو تغير الحمض النووي. البروموفينول الأزرق هو صبغة تستخدم لتتبع خيوط الحمض النووي الأصغر حجمًا التي تحتوي على حوالي 400 زوج قاعدي ، في حين أن زيلين سيانول أفضل لخيوط الحمض النووي الأكبر التي تضم ما يصل إلى 8000 زوج قاعدي. يجب ألا تكون الصبغة المختارة تفاعلية أو تغير الحمض النووي.
دور الجلسرين في الرحلان الكهربائي لجيل الاغاروز
عند تجهيز عينة الحمض النووي الخاصة بك الكهربائي، سوف تحتاج إلى إضافة الجلسرين والماء مع صبغات التحميل. الجلسرين هو مادة ثقيلة ذات شراب تعطي كثافة أكبر لعينة الحمض النووي قبل إدخالها في الآبار في أحد طرفي صفيحة الهلام.
بدون الجلسرين ، ستشتت عينة الحمض النووي بدلاً من الغرق وتشكيل طبقة في البئر كما يفترض أن تفعل لتشكيل سلم من الحمض النووي.
صبغ التتبع في صفحة SDS
الرحلان الكهربائي لجيل دوديسيل كبريتات الصوديوم (SDS PAGE) هو تقنية مناسبة لفصل البروتينات والأحماض الأمينية ، والتي تكون أصغر وأكثر تعقيدًا من جزيئات الحمض النووي الخطية. يستخدم بولي أكريلاميد (هلام SDS PAGE) بدلاً من هلام الاغاروز للرحلان الكهربي.
يضاف Bromophenol blue (BPB) إلى المخزن المؤقت للعينة كملف تتبع الصبغة يتحرك في نفس اتجاه فصل البروتينات ويحدد حافتها الأمامية.
دور الصبغة الملزمة للحمض النووي
صبغة ربط الحمض النووي مثل برتقالي اللون يمكن إضافة بروميد إيثيديوم إلى مادة هلامية أو إلى محلول الرحلان الكهربائي. كما يوحي الاسم ، تلتصق الصبغة بجزيء الحمض النووي.
يجب توخي الحذر الشديد عند التعامل مع هذه الصبغة المطفرة لأنها يمكن أن ترتبط بالحمض النووي في خلايا الجلد. على عكس صبغات التتبع ، بروميد الإيثيديوم يتألق مشرق تحت أشعة فوق البنفسجية، مما يجعل أشرطة الحمض النووي مرئية.