عند العمل باستخدام كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء (HPLC) ، فإن المعايرة الجيدة ضرورية للغاية لضمان نتائج موثوقة وعالية الجودة. تبدأ المعايرة الصحيحة لجهاز HPLC بعمل معيار معايرة مناسب. في معظم الحالات ، تتطلب المعايرة في الواقع سلسلة من المعايير لزيادة التركيز من أجل إنتاج ما يعرف بمنحنى المعايرة. هذا خط مرسوم ومعادلة مرتبطة به تصف العلاقة بين تركيز المادة الكيميائية التي يتم اختبارها واستجابة كاشف HPLC.
حدد المادة الكيميائية التي ترغب في اختبارها لاستخدام HPLC ("التحليل"). على سبيل المثال ، قد ترغب في اختبار سلسلة من المشروبات الغازية لمحتوى الفركتوز ، وفي هذه الحالة سيكون الفركتوز هو التحليل.
الحصول على كمية من المادة الكيميائية التحليلية بنقاوة مناسبة. عادة يجب أن تكون درجة النقاء أعلى من 99٪ ويجب شراء المادة التحليلية من شركة توريد مواد كيميائية مرموقة. في حالة الفركتوز ، على سبيل المثال ، يمكنك شراء الفركتوز النقي من بائع كيميائي وليس من محل بقالة.
حدد الحد الأقصى والحد الأدنى من التركيزات المتوقعة من المادة التحليلية في العينات التي تنوي اختبارها على جهاز HPLC. في حالة المشروبات الغازية ، ستفحص ملصقات المشروبات وتحدد أدنى وأعلى محتوى من الفركتوز بين المشروبات التي ستختبرها. ضع في اعتبارك أن العينة الأولية (المشروب الغازي) قد يتم تخفيفها أو التلاعب بها بطريقة أخرى أثناء التحضير للتحليل (اعتمادًا على طريقة HPLC المستخدمة) وبالتالي قد يكون تركيز المادة التحليلية في العينات المحقونة بالفعل في HPLC تم التعديل. يجب مراعاة تركيز المادة التحليلية في العينات التي يتم تشغيلها على HPLC.
حدد المذيب الذي ستحل فيه المادة التحليلية لتكوين معايير المعايرة. يجب أن يكون هذا المذيب قادرًا على إذابة المادة التحليلية بشكل صحيح على نطاق واسع نسبيًا من التركيز (على الأقل مرتفع كما هو الحال في العينات التي تنوي اختبارها). بالإضافة إلى ذلك ، يجب أن يكون هذا المذيب مثالياً مشابهًا تمامًا لـ "الطور المتحرك": المذيب المستخدم لنقل العينات عبر أداة HPLC.
احسب كمية المادة التحليلية المطلوبة لعمل حل "معيار المخزون" للتحليل. تم العثور على ذلك بضرب التركيز المطلوب لمعيار المخزون بالحجم المطلوب. يجب أن يكون تركيز المادة التحليلية في هذا المحلول أعلى بنسبة 10٪ على الأقل من أعلى تركيز متوقع في العينة. إذا كان أعلى تركيز متوقع للفركتوز في عينة مشروب غازي هو 8 جرامات / 100 مليلتر ، فيمكن جعل معيار المخزون بتركيز 10 جرامات من الفركتوز / 100 مليلتر. الحجم المعقول هو 500 مليلتر ، وبالتالي فإن 8/100 مل × 500 مل = 40 جرامًا من الفركتوز ستكون مطلوبة.
قم بوزن الكمية المطلوبة من المادة التحليلية إلى مستوى مناسب من الدقة. غالبًا ما تكون قيمة الوزن بالجرام المحددة لواحد أو منزلتين عشريتين مناسبة ، ولكن قد تكون هناك حاجة إلى مزيد من الدقة لبعض الطرق.
انقل المادة التحليلية التي تم وزنها إلى دورق حجمي بالحجم المطلوب وأضف المذيب المطلوب إلى علامة الملء الموجودة على القارورة. يزيد استخدام دورق حجمي (بدلاً من دورق متدرج ، على سبيل المثال) من دقة قيمة التركيز القياسي للمخزون. تأكد من نقل كل المادة التحليلية إلى القارورة ؛ استخدم بعض المذيب لغسله ، إذا لزم الأمر.
قم بعمل سلسلة من التخفيفات المتغيرة لمعيار المخزون عن طريق نقل الأحجام المعروفة لمعيار المخزون إلى قوارير حجمية ، باستخدام ماصات لنقل دقيق ، ثم إضافة مذيب. يجب أن يكون أدنى تركيز قياسي أقل من أدنى عينة متوقعة ليتم تحليلها. في مثال المشروبات الغازية ، إذا كان أقل تركيز متوقع للفركتوز في العينة هو 2 جرام / 100 مل ، فيمكن عندئذٍ وضع معيار 1 جرام / 100 مل. سوف يتم ذلك عن طريق التخفيف بمقدار عشرة أضعاف لمعيار المخزون. يجب أن تتضمن السلسلة القياسية ما مجموعه 5 أو 6 تركيزات ، لذلك قد تكون هناك حاجة إلى تخفيفات إضافية لإنتاج معايير ربما 3 و 5 و 8 جرامات من الفركتوز / مل. لديك الآن سلسلة من الحلول القياسية لمعايرة HPLC.