Гель-електрофорез - це техніка, коли біологічні молекули відокремлюють одна від одної та визначають під час біологічних досліджень або медичної діагностики. З часу їх розробки в 1970-х роках ці методи були безцінними для ідентифікації генів (ДНК) та генних продуктів (РНК та білків), що становлять інтерес для досліджень. В останні роки з’явилися новіші методики, які надають більшу конкретність і детальність того, що відбувається в живих системах. Хоча ці методи не витісняють методи електрофорезу, а вдосконалені маніпуляції можуть розширити життєздатність методики, важливо усвідомити, що гель-електрофорез може і що не може робити.
Електрофорез має обмежений аналіз зразків
Електрофорез характерний для будь-якої тканини, яку ви взяли. Наприклад, якщо ви проводите саузерн-блот (вид електрофорезу) на мазку щоки, ви дивитесь на гени з епітеліальних клітин щоки і ніде більше у вашому тілі. Часом це може бути корисно, але дослідники часто цікавляться більш розповсюдженими ефектами.
Такі методи, як гібридизація in situ (ISH), можуть взяти ділянку тканини та проаналізувати експресію генів на кожній невеликій ділянці цієї проби. Таким чином, дослідники можуть досліджувати кожну область мозку у зразку за допомогою ІШ, тоді як методи електрофорезу можуть розглядати лише кілька областей одночасно.
Вимірювання електрофорезу не є точним
Гель-електрофорез може ефективно відокремлювати подібні білки з різною вагою (це техніка, яка називається Вестерн-блот). Він може більш точно розділити їх за допомогою техніки, відомої як 2d електрофорез; це часто зустрічається в протеоміці.
На жаль, усі вимірювання, зроблені за цією методикою, у кращому випадку є напівкількісними. Щоб отримати точну масу (масу) білків, після очищення білка електрофорезом необхідно застосовувати мас-спектроскопію. Крім того, порівняння відносної кількості різних молекул залежить від щільності смуг (темряви) різних плям на гелі. Цей метод має певний рівень помилок, і зразки, як правило, запускаються кілька разів, щоб отримати чисті результати.
Необхідний значний стартовий зразок
Електрофорез - це техніка виділення та візуального виявлення різних біомолекул. Це робиться шляхом пропускання електричного струму через гель для розділення заряджених молекул різної ваги. Якщо молекула, яка вас цікавить, недостатньо поширена, її смуга буде практично невидимою і важкою для вимірювання.
ДНК і РНК можна дещо посилити перед проведенням електрофорезу, але це непрактично робити з білками. Тому для проведення цих аналізів необхідна велика проба тканини. Це може обмежити корисність методики, особливо при медичному аналізі. Практично неможливо провести електрофорез на зразках з однієї клітини; проточна цитометрія та імуногістохімія частіше використовуються для оцінки клітинної експресії білків. Методика, що називається ПЛР, чудово підходить для точного вимірювання незначної кількості РНК.
Візуалізувати можна лише певні молекули
Електрофорез чудово відокремлює та ідентифікує середні та великі біомолекули. Однак багато молекул, які дослідники хочуть розглянути, менші; дрібні гормони, нейромедіатори та іони не можна виміряти електрофорезом. Це з двох причин: вони не реагують належним чином на препарат для електрофорезу (зазвичай це техніка називається SDS PAGE), і навіть якщо вони це зробили, вони занадто малі, щоб правильно їх відокремити, і вони б вибилися з нижньої частини гель. Натомість ці молекули вимірюють такими методами, як RIAA (радіоімуноаналізи) та ELISA (імуноферментний аналіз).
Електрофорез має низьку пропускну здатність
Гель-електрофорез, як правило, має низьку пропускну здатність, тобто він не дає даних особливо швидко. Контрастний електрофорез, де можна одночасно розглянути невелику жменьку молекул РНК, за допомогою ПЛР (полімеразної ланцюгової реакції), яка одночасно може оцінити тисячі зразків. Подібним чином проточна цитометрія може проводити вимірювання з тисяч окремих клітин і ускладнювати кореляції, тоді як електрофорез масово розглядає клітини і не може зробити такого тонкого дискримінація. ПЛР та проточна цитометрія представляють масово паралельні та послідовні процеси, відповідно, і обидва значно перевершують можливості електрофорезу для отримання даних досліджень.