Гель-електрофорез є загальновживаною лабораторною методикою, що має багато практичних застосувань, включаючи дактилоскопію та секвенування геному. Процес передбачає відокремлення ДНК фрагменти з використанням електричного струму при одночасному відстеженні швидкості молекулярного руху через фільтруючий гель.
Додавання синього або помаранчевого барвника для відстеження до безбарвних зразків ДНК дозволяє побачити ваш зразок і отримати інформацію про те, як молекули ДНК рухаються під час електрофорезу. Ідентифікація базується на розмірі смуг ДНК на гелі після міграції молекул.
Як працює гель-електрофорез
Гель-електрофорез витягує фрагменти ДНК через гель, використовуючи електричний струм, щоб виділити та ідентифікувати молекули ДНК за розміром та електричним зарядом. Гель часто роблять з порошок агарози - полісахарид, витягнутий з морські водорості.
Агарозу додають до буферного розчину води та солі, і суміш нагрівають та охолоджують, утворюючи пористий гель, який буде діяти як фільтруюча матриця під час процедури електрофорезу. Потім гель поміщають у блок електрофорезу і покривають буферним розчином, який проводить
електрика.Розчини, що містять ДНК і завантажувальні барвники, піпетуються у невеликі лунки в гелі, які необхідно зробити під час приготування гелю. Барвникидопомогти тобічітко бачити зразок що ви додаєте в гелеві лунки, розташовані поблизу негативного електрода блоку електрофорезу.
Позитивний електрод розташований на протилежному кінці. Відомий стандарт фрагментів ДНК розміщений у першій лунці, яка створить сходи смуг ДНК для порівняння та ідентифікації.
Фосфатний кістяк молекул ДНК дає ДНК негативний заряд. Протилежності притягуються, отже, молекули ДНК притягуються до позитивного електрода і починають рухатися, або “мігрувати”, коли вмикається електричний струм.
Фрагменти ДНК менших розмірів рухаються швидше, ніж фрагменти великих розмірів, оскільки вони стикаються з меншим опором, коли вони мігрують через пористу матрицю гелю. Фрагменти ДНК подібного розміру утворюють смуги ДНК у гелі.
Завантаження барвника Призначення та значення
ДНК безбарвна, тому додавання відстеження барвників вам допоможе зразок визначити швидкість руху білкових молекул різного розміру в гелі під час електрофорезу. Приклади завантаження барвників, які рухаються із зразком ДНК, включають бромофенолблакитний і ксилол ціанол.
Обраний барвник не повинен реагувати або змінювати ДНК. Бромофеноловий синій - це барвник, який використовується для відстеження ланцюгів ДНК менших розмірів, що містять близько 400 пар основ, тоді як ксилол-ціанол краще для більших ланцюгів ДНК із до 8000 пар основ. Обраний барвник не повинен реагувати або змінювати ДНК.
Роль гліцерину в електрофорезі в агарозному гелі
При підготовці зразка ДНК для електрофорез, вам потрібно буде додати гліцерин і воду разом із завантажувальними барвниками. Гліцерин - важка сирописта речовина, яка надає більшу щільність зразку ДНК перед тим, як його вставити в лунки на одному кінці гелевого листа.
Без гліцерину зразок ДНК розійдеться, замість того, щоб потонути і сформувати шар у лунці, як це передбачається для формування сходів ДНК.
Відстеження барвника на SDS PAGE
Електрофорез додецилсульфат натрію в поліакриламідному гелі (SDS PAGE) - це техніка, придатна для розділення білків та амінокислот, які є меншими та складнішими, ніж лінійні молекули ДНК. Поліакриламід (гель SDS PAGE) використовується замість агарозного гелю для електрофорезу.
Бромофенольний синій (BPB) додають до буфера для зразків як відстеження барвника який рухається в тому ж напрямку, що розділяє білки, і розмежовує їх передній край.
Роль барвника, що зв’язує ДНК
ДНК-зв'язуючий барвник, такий як помаранчевого кольору бромід етидію можна додавати в гель або в буфер для електрофорезу. Як випливає з назви, барвник прикріплюється до молекули ДНК.
Потрібно бути дуже обережним при роботі з цим мутагенним барвником, оскільки він може зв’язуватися з ДНК у клітинах шкіри. На відміну від барвників, що відслідковують, бромід етидію флуоресцирує яскраво під УФ-світло, роблячи видимими смуги ДНК.