У молекулярній біології може бути гарним вибором буфера та підготовкою до різних етапів виділення ДНК різниця між переходом до експресії білка або відкриттям іншого набору для підготовки до максимуму для початку більше. Незважаючи на свою вирішальну важливість, буферні рецепти часто є саме такими - рецептами, написаними без пояснення чи обгрунтування різних компонентів. Одним з таких буферів є буфер глюкоза-трис-ЕДТА або ГТД.
Для чого використовується GTE?
ГТД використовується для ресуспендування пелет бактеріальних клітин перед лізисом (розкриттям) клітин та збиранням плазмідної ДНК всередині. Лізоцим, який пом'якшує клітинні мембрани, часто додають разом з буфером GTE. Досягнення гомогенної суспензії цілих клітин на цьому етапі, щоб доданий згодом розчин лізису міг потрапити до всіх клітин, є ключовим фактором для отримання хорошого виходу ДНК. GTE призначений для цього, одночасно забезпечуючи стабільне середовище для ДНК.
Глюкоза для осмолярності
50мМ (мілімолярний) цукор глюкози додають до буфера ГТД для підтримки осмолярності там, де концентрація розчиненої речовини поза клітинами близька до концентрації всередині клітин. Це запобігає передчасному лізису клітин, що може спричинити менший вихід ДНК через агрегацію та деградацію. Інші компоненти буфера також сприяють осмолярності розчину, але глюкоза, будучи неелектролітом, є хорошим вибором, оскільки він не заважає буферу розчину властивості.
Трис для стабільності рН
Трис - це коротка назва трис (гідроксиметил) амінометан, який є дуже поширеним буфером рН. У випадку буфера GTE кислотну сіль (Tris-HCl) додають до буфера при концентрації 25 мМ. Це підтримує рН розчину на рівні майже фізіологічного 8,0, ідеальний рН для запобігання кислотного гідролізу (деградації) плазмідної ДНК та небажаних побічних реакцій інших клітинних компонентів.
EDTA запобігає деградації ДНК
ЕДТА або етилендіамінтетраоцтова кислота захоплює або «хелатує» іони металів з розчину, не даючи їм брати участь у небажаних побічних реакціях. У буфері GTE додається ЕДТА при 10 мМ. Його основне призначення полягає в буфері, щоб округлити вільний цинк, магній і кальцій, тим самим запобігаючи деградації ДНК певними шляхами, для яких потрібні ці метали.
Деякі важливі поради
Тримайте свій буфер ГТЕ холодним і робіть його в невеликих кількостях, щоб запобігти росту небажаних бактерій у ньому. Цукор і контрольований рН забезпечують чудове середовище для зростання. Завжди використовуйте очищену воду. Водопровідна вода може мати надлишок іонів металів з труб, що може перекрити здатність ЕДТА захоплювати. Якщо ви підозрюєте, що у вашому зразку присутня заважаюча РНК, додайте РНКазу А у кількості 100 мікрограмів на мілілітр у ваш буфер GTE, щоб усунути проблему.