Тріс, або трис (гідроксиметил) амінометан, є загальним біологічним буфером, який використовується протягом усього процесу екстракції ДНК. Під час вилучення з будь-якої кількості джерел ДНК чутлива до рН. Під час лізису клітин, видалення небажаних клітинних компонентів та осадження, трис використовується для підтримки стабільного рН. Крім того, він відіграє особливо важливу роль у лізисі клітин.
TL; ДР (занадто довгий; Не читав)
Екстракція ДНК - це процес, чутливий до рН, і використання трис-буфера допомагає підтримувати рН стабільним при лізисі та екстракції клітин.
Тріс як буфер
Оскільки рН може впливати на цілий ряд клітинних факторів і на нього впливати, підтримка стабільного рН є важливою для експериментальної науки. Біологічні буфери, такі як трис, важливі, оскільки вони можуть підтримувати стабільний рН, незважаючи на вплив, який в іншому випадку може змінити рН. Тріс (гідроксиметил) амінометан з рКа 8,1 є ефективним буфером між рН 7 і 9. Через свій нейтральний діапазон, трис є загальновживаним буфером в біологічних лабораторіях. Однак трис-буфер чутливий до температури, і його слід використовувати при тій температурі, при якій він спочатку був pH, щоб уникнути неточності.
Лізис клітин
Лізис, або розкриття клітин, є першим кроком екстракції ДНК. Це досягається буфером, що містить трис та ЕДТА (етилендіамінтетраоцтова кислота). ЕДТА пов'язує двовалентні катіони, такі як кальцій і магній. Оскільки ці іони допомагають підтримувати цілісність клітинної мембрани, усуваючи їх за допомогою ЕДТА, дестабілізує мембрану. Тріс - основний буферний компонент; його головна роль полягає в підтримці рН буфера в стабільній точці, як правило, 8,0. Крім того, тріс ймовірно взаємодіє з LPS (ліпополісахаридом) у мембрані, слугуючи для дестабілізації мембрани далі.
Tris захищає ДНК від змін рН
Коли клітини розпадаються, їх ДНК і вміст розливаються в буфер. Крім того, часто включаються РНКаза А (руйнує РНК), протеази (руйнує білки) та SDS (додецилсульфат натрію, солюбілізує фрагменти мембрани). У сукупності цей суп із клітинного вмісту та фрагментованої РНК та білків може мати великий вплив на рН розчину. Оскільки ДНК чутлива до рН, для трису важливо буферувати суп і підтримувати рН на постійному рівні.
Осадження ДНК
На завершальній стадії вилучення ДНК з розчину витягується сама ДНК. У цей момент ДНК розчиняється в буфері. Для вилучення з розчину ДНК роблять нерозчинною, додаючи етанол або ізопропанол (ізопропіловий спирт). Коли це буде зроблено, ДНК стає очевидною у розчині як біла речовина, що в'яжеться. Хоча таким чином ДНК може бути виділена з решти клітинних компонентів, вона не є «придатною для використання», коли вона нерозчинна. Після ізоляції спирт видаляється, і ДНК повинна бути повернута в біологічний буфер, такий як трис, для використання.
Зроби це сам
Хоча вилучення ДНК зазвичай роблять у дослідницьких лабораторіях, як правило, з використанням одного з ряду комерційно доступні набори, кожен може зробити екстракцію ДНК вдома, використовуючи звичайні предмети побуту та зелений колір гороху або шпинату. У цьому випадку ні трису, ні будь-якого біологічного буфера немає для захисту ДНК від змін рН. Однак це наочний спосіб допомогти студентам зв’язатися з клітинною ДНК.