Як створюється рекомбінантна ДНК?

Рекомбінантна ДНК (дезоксирибонуклеїнова кислота) - це синтетичний тип нуклеїнової кислоти, створений шляхом зв’язування ДНК послідовності разом, які природним чином не існували б за звичайних обставин та середовища умови.

Процес отримання рекомбінантної ДНК зазвичай здійснюється за допомогою рекомбінантної плазміди. Зокрема, це зроблено за допомогою передової технології ДНК у біології та генетиці, відомої як клонування генів. Рекомбінантна ДНК потрапляє в клітину, яка потім виробляє абсолютно новий білок, і використовується для синтезу ліків, антитіл або конкретних білків лише для досліджень.

ДНК з донорського організму або біологічного джерела спочатку витягується з клітин, а потім піддається процесу різання, відомого як ферментативна рестрикція. Це генерує фрагменти ДНК, які містять ген або гени, що представляють інтерес. Потім ці фрагменти можна "клонувати" (тобто вставляти) або наклеювати на фрагменти з організму-реципієнта.

Потім їх вставляють у більші молекули ДНК («рекомбінантну плазміду»), які поміщають у бактерії і дають їм розмножуватися. Потім рекомбінантна ДНК відновлюється і перевіряється.

Докладніше про плюси та мінуси технології рекомбінантної ДНК.

Спершу ДНК слід витягти та очистити з інших клітинних молекул, таких як рибонуклеїнові кислоти (РНК), білки та структури, такі як клітинні мембрани. Для цілей клонування ДНК отримують з ядра і відомий як «геномна ДНК». Один із поширених методів отримання ДНК екстракція здійснюється ультрацентрифугуванням клітинних компонентів у градієнті щільності, складеному бромідом етидію в цезії хлорид.

Альтернативно, серія лужних і сольових буферних змивів також може бути використана для відновлення ДНК. Після того, як це випаде в осад і очиститься від усіх інших небажаних забруднень, ДНК можна розрізати на фрагменти.

Рестрикційні ферменти - це ферменти, які розрізають дуже специфічні послідовності ДНК; їх використовують для створення унікальних фрагментів ДНК. Цей процес гарантує, що жодні неточні, неправильні або небажані послідовності не генеруються та не стають випадково включена в остаточну рекомбінантну ДНК, що може призвести як до експериментальної невдачі, так і до загибель клітин.

Для генерування бажаних фрагментів ДНК використовується специфічний одиничний (або поєднаний) фермент (ферменти) для розрізання або перетравлення ДНК. Потім фрагменти очищають за допомогою гель-електрофорезу, який відокремлює їх від небажаної ДНК. Технологія грубої ДНК просто передбачає механічний зсув, який розриває довші сегменти ДНК на більш дрібні, які можна використовувати для клонування.

Лігування - це процес склеювання або об’єднання фрагментів ДНК донора та реципієнта (або вектора) для створення рекомбінантної молекули плазмідної ДНК. В ідеалі ферменти рестрикції, обрані для створення фрагментів, були б дуже ретельно продумані і розроблені таким чином, щоб вони дозволяли складати ці біти, як головоломка.

Для цього переважні ферменти рестрикції, які виробляють сумісні «липкі кінці», такі, що всі сумісні фрагменти природним чином з’єднуються між собою. В іншому випадку фермент ДНК-лігази можна використовувати для з’єднання сегментів ДНК за допомогою фосфодіефірних зв’язків.

Процес трансформації або теплового удару використовується для введення молекули рекомбінантної ДНК у бактеріальну клітину-хазяїна, яка потім може генерувати багато копій синтетичної ДНК. Ці бактерії вирощують на агарових пластинах, культивують у спеціальних бактеріальних бульйонах, а потім лізують для вивільнення рекомбінантної ДНК. Нарешті, ДНК можна перевірити шляхом секвенування ДНК, функціональних експериментів та перетравлення ферментів рестрикції.

Технологія рекомбінантної ДНК використовується для всього, починаючи від академічних лабораторних експериментів і закінчуючи створенням фармацевтичних препаратів. Це також важлива частина послідовності ДНК та ідентифікації генів.

Ви можете прочитати більше з цього приводу ДНК-технологія тут.

Детальніше про різницю між рекомбінантною ДНК та генною інженерією.