Dondurarak Kırma Nedir ve Hücre Biyolojisinde Neden Yararlıdır?

Hücre zarları, fosfolipidlerden ve bağlı veya gömülü proteinlerden oluşur. Zar proteinleri hücrenin metabolizmasında ve yaşamında hayati rol oynar. Hücre zarındaki yapışma proteinlerini, taşıma proteinlerini ve protein kanallarını görselleştirmek veya karakterize etmek için sıradan mikroskopi kullanamazsınız. Elektron mikroskobu ve donmuş hücre zarlarını ayıran "donma kırılması" adı verilen bir teknik kullanarak, membran yapısının görselleştirilmesine ve denizdeki proteinlerin organizasyonuna izin verir. fosfolipidler. Diğer yöntemleri dondurarak kırma ile birleştirmek, yalnızca farklı hücre zarlarının yapısını anlamamıza yardımcı olmaz ve ancak belirli proteinlerin, bakterilerin ve bakterilerin işlevinin görselleştirilmesine ve ayrıntılı analizine izin verir. virüsler.

Sıvı nitrojen kullanılarak biyolojik doku numuneleri veya hücreler, hücre bileşenlerini hareketsiz hale getirmek için hızla dondurulur. Hücre zarları, hidrofobik veya sudan nefret eden lipit kuyruklarının işaret ettiği çift tabaka adı verilen iki fosfolipit tabakasından oluşur. zarın içi ve lipit molekülünün hidrofilik veya su seven uçları dışarıyı ve zarın içine doğru bakar. hücre. Dondurulmuş numune, ince doku dilimlerini kesmek için bıçak benzeri bir alet olan bir mikrotom ile kırılır veya kırılır. Bu, hücre zarının iki katman arasında tam olarak ayrılmasına neden olur, çünkü hidrofobik lipit kuyrukları arasındaki çekim en zayıf noktayı temsil eder. Kırılmanın ardından numune, "dondurarak aşındırma" adı verilen bir vakum prosedürüne tabi tutulur. Kırılan yüzey Numune, kırılmanın hatlarını takip eden stabil bir kopya oluşturmak için karbon ve platin buharı ile gölgelenir uçak. Asit, kopyaya yapışan organik materyali sindirmek için kullanılır ve kırık membran yüzeyinin ince bir platin kabuğunu bırakır. Bu kabuk daha sonra elektron mikroskobu ile analiz edilir.

Dondurarak aşındırma, sabitlenmemiş, donmuş ve dondurarak parçalanmış bir biyolojik numunenin vakumla kurutulmasıdır. Vakumlu kurutma prosedürü, marketlerde paketlenen ve satılan meyve ve sebzelerin dondurularak kurutulmasına benzer. Dondurarak aşındırma olmadan, hücresel yapının birçok detayı buz kristalleri tarafından gizlenir. Derin veya dondurarak aşındırma adımı, orijinal dondurarak kırılma yöntemini geliştirip genişleterek, çeşitli aktiviteler sırasında hücre zarlarının gözlemlenmesine olanak tanır. Sadece membran yapısının değil, aynı zamanda hücre içi bileşenlerin de analizine izin verir. bakteriler, virüsler ve büyük hücresel proteinler hakkında ayrıntılı yapısal bilgi sağlar. kompleksler.

Elektron mikroskobu, bakteriler, virüsler, hücre içi bileşenler ve hatta proteinler gibi en küçük organizmaları veya yapıları bir milyondan fazla kez ortaya çıkarabilir ve büyütebilir. Görselleştirme, ultra ince bir numunenin bir elektron ışını ile bombardıman edilmesiyle oluşturulur. İki elektron mikroskobu yöntemi, taramalı elektron mikroskobu veya SEM ve transmisyon elektron mikroskobu veya TEM'dir. Dondurarak kırılma numuneleri rutin olarak TEM ile analiz edilir. TEM, SEM'den daha iyi çözünürlüğe sahiptir ve 3 nanometre kopyaya kadar yapısal bilgi sunar.

Dondurarak kırılma elektron mikroskobunun geliştirilmesi ve kullanılması, hücre plazma zarlarının lipid çift katmanlarından oluştuğunu gösterdi ve proteinlerin hücre zarları içinde nasıl organize edildiğini netleştirdi. Donma kırılması, hücre zarlarının iç kısmına benzersiz bir görünüm verir, çünkü zar fosfolipitlerini iki zıt ve tamamlayıcı tabaka veya yüze böler ve ayırır. İlk dondurarak kırma makinesinin piyasaya sürülmesinden bu yana geçen 50 yıldan fazla bir süre içinde, hücre zarı hakkında yapısal bilgi elde etmenin tek yolu platin kopya yapmaktır. Teknik, spesifik proteinlerin hücre zarında yüzer mi yoksa sabit mi olduğunu ve bazı proteinlerin bir araya gelip gelmediğini ve nasıl toplandığını gösterir. Spesifik proteinleri hedef alan antikorların kullanıldığı daha yeni bir yöntem, proteinleri ve hücre zarındaki işlevlerini tanımlamak için donma kırılması ile birleştirilir.