DNA Klonlama: Tanım, İşlem, Örnekler

Koyun Dolly gibi tüm organizmaları klonlamak mümkündür, ancak DNA klonlaması farklıdır. yapmak için moleküler biyoloji tekniklerini kullanır. DNA dizilerinin veya tek genlerin özdeş kopyaları.

Genetik mühendisliği yöntemleri kullanılarak, DNA genetik kodunun segmentleri tanımlanır ve izole edilir. DNA klonlama daha sonra kopyalar nükleik asit segmentlerdeki diziler.

Ortaya çıkan özdeş kopyalar, daha fazla araştırma veya biyoteknoloji uygulamaları için kullanılabilir. Genellikle kopyalanan gen, tıbbi tedavilerin bir parçasını oluşturabilen bir proteini kodlar. DNA teknolojisi dahil DNA klonlama genlerin nasıl çalıştığının ve insanların genetik kodunun vücudun işleyişini nasıl etkilediğinin anlaşılmasını desteklemektedir.

DNA klonlama, gelişmiş organizmaların genetik kodunu içeren kromozomlarda yer alan DNA segmentlerinin özdeş kopyalarını oluşturmaya yönelik moleküler biyoloji sürecidir.

Süreç, büyük miktarlarda hedef DNA dizileri. DNA klonlamanın amacı, hedef DNA dizilerinin kendilerinin veya hedef dizilerde kodlanmış proteinlerin üretilmesidir.

DNA klonlamada kullanılan iki yönteme denir. plazmit vektörü ve polimeraz zincir reaksiyonu (PCR). İçinde plazmit vektörü yöntemi, DNA iplikçikleri kullanılarak kesilir. Kısıtlama enzimleri DNA fragmanları üretmek için ve elde edilen segmentler, daha fazla çoğaltma için plazmit adı verilen klonlama vektörlerine yerleştirilir. Plazmitler, daha sonra DNA kopyalarını veya kodlanmış proteinleri üreten bakteri hücrelerine yerleştirilir.

İçinde PCR yöntemi, kopyalanacak DNA iplikçiklerinin segmenti olarak adlandırılan enzimlerle işaretlenmiştir. primerler. Bir polimeraz enzimi, DNA zincirinin işaretli kısmının kopyalarını yapar. Bu yöntem kısıtlama enzimleri kullanmaz ve küçük örneklerden klonlanmış DNA üretebilir. Bazen iki DNA teknolojisi yöntemi, her birinin en iyi özelliklerini genel bir reaksiyona dahil etmek için birlikte kullanılır.

Yöntemin vektörü, klonlanacak hedef DNA segmentini tutmak için kullanılan plazmide karşılık gelir. Plazmitler küçük dairesel şeritlerdir. kromozomal olmayan DNA bakteri ve virüsler de dahil olmak üzere birçok organizmada bulunur.

Bakteriyel plazmitler, daha fazla çoğaltma için hedef DNA segmentini bakteri hücrelerine sokmak için kullanılan vektördür.

Hedef DNA'nın seçilmesi ve izole edilmesi: DNA klonlama işlemi başlamadan önce, DNA dizilerinin, özellikle DNA bölümlerinin başlangıç ​​ve bitişlerinin tanımlanması gerekir.

Bu tür DNA dizileri, bilinen dizilere sahip mevcut klonlanmış DNA kullanılarak veya hedef DNA dizisi tarafından üretilen protein incelenerek bulunabilir. Dizi bir kez bilindiğinde, karşılık gelen kısıtlama enzimleri kullanılabilir.

Hedef DNA'nın restriksiyon enzimleri ile kesilmesi: Kısıtlama enzimleri, hedef dizilerin başında ve sonunda DNA kodunu aramak için seçilir.

Restriksiyon enzimleri, kısıtlama bölgeleri adı verilen özel kodlanmış baz çiftleri dizisi bulduğunda, kendilerini o konumda DNA'ya bağlarlar ve kendilerini DNA molekülünün etrafına sararak iplik. Hedef diziyi içeren kesilmiş DNA parçaları artık çoğaltma için kullanılabilir.

Plazmit vektörünün seçilmesi ve hedef DNA'nın yerleştirilmesi: Uygun bir plazmit ideal olarak, hedef DNA'nın kesildiği DNA zinciriyle aynı DNA kodlama dizilerini içerir. Plazmitin dairesel DNA zinciri, hedef DNA'yı kesmek için kullanılanla aynı kısıtlama enzimleriyle kesilir.

bir DNA ligaz enzimi DNA segmenti bağlanmasını teşvik etmek için kullanılır ve hedef DNA segmentinin uçları, plazmit DNA'nın kesik uçları ile bağlanır. Hedef DNA şimdi dairesel plazmit DNA zincirinin bir parçasını oluşturur.

Plazmidi bir bakteri hücresine yerleştirme: Plazmit, klonlanacak DNA dizisini içerdiğinde, gerçek klonlama adı verilen bir süreç kullanılarak gerçekleşebilir. bakteri dönüşümü. Plazmitler, E. coli gibi bir bakteri hücresine yerleştirilir. coli ve yeni DNA segmentlerine sahip hücreler, kopyaları ve karşılık gelen proteinleri üretmeye başlayacak.

Bakteri transformasyonunda, konakçı hücreler ve plazmitler vücut sıcaklığında yaklaşık 12 saat birlikte inkübe edilir. Hücreler bazı plazmitleri emer ve onlara kendi plazmit DNA'ları gibi davranır.

Klonlanmış DNA ve proteinlerin hasat edilmesi: DNA klonlama için kullanılan çoğu plazmit, antibiyotik direnç genleri DNA'larına dahil edildi. Bakteri hücreleri yeni plazmitleri emdikçe antibiyotiklere karşı dirençli hale gelirler.

Kültür antibiyotiklerle tedavi edildiğinde, yalnızca yeni plazmitleri emen hücreler hayatta kalır. Sonuç, klonlanmış DNA'ya sahip saf bir bakteri hücresi kültürüdür. Bu DNA daha sonra hasat edilebilir veya karşılık gelen protein üretilebilir.

PCR yöntem daha basittir ve mevcut DNA'yı yerinde kopyalar. Restriksiyon enzimleri ile kesme veya ekleme gerektirmez. plazmitDNA diziler. Bu, özellikle sınırlı sayıda DNA dizisine sahip DNA örneklerinin klonlanması için uygun olmasını sağlar. Yöntem DNA'yı klonlayabilirken, karşılık gelen proteinin üretimi için kullanılamaz.

DNA zincirlerinin çözülmesi: Kromozomlardaki DNA, çift sarmal bir yapıda sıkıca sarılır. DNA adı verilen bir işlemde 96 santigrat dereceye kadar ısıtmak denatürasyon DNA molekülünün çözülmesini ve iki zincire ayrılmasını sağlar. Bu ayırma gereklidir, çünkü bir seferde yalnızca tek bir DNA dizisi klonlanabilmektedir.

Primerlerin seçilmesi: Plazmid vektör DNA klonlamada olduğu gibi, klonlanacak DNA dizileri, DNA bölümlerinin başlangıç ​​ve bitişlerine özel vurgu yapılarak tanımlanmalıdır. Primerler, spesifik DNA kod dizilerine bağlanan enzimlerdir ve hedef DNA parçalarını işaretlemek için seçilmeleri gerekir. Doğru primerler, hedef bölümlerin başlangıçlarını ve sonlarını işaretlemek için DNA molekül dizilerine bağlanacaktır.

Primerleri bağlamak için reaksiyonu tavlama: Reaksiyonun yaklaşık 55 santigrat dereceye kadar soğutulmasına denir. tavlama. Reaksiyon soğudukça, primerler aktive olur ve kendilerini hedef DNA segmentinin her iki ucundaki DNA zincirine bağlarlar. Primerler yalnızca belirteç görevi görür ve DNA zincirinin kesilmesi gerekmez.

Hedef DNA segmentinin aynı kopyalarını üretmek: denilen bir süreçte uzantı, ısıya duyarlı TAQ polimeraz enzimi reaksiyona eklenir. Reaksiyon daha sonra enzimi aktive ederek 72 santigrat dereceye kadar ısıtılır. Aktif DNA polimeraz enzimi, primerlere bağlanır ve aralarındaki DNA dizisini kopyalar. İlk DNA dizileme ve klonlama işlemi tamamlandı.

Klonlanmış DNA veriminin arttırılması: İlk tavlama ve uzatma işlemi, mevcut DNA iplik parçalarının nispeten az sayıda kopyasını oluşturur. Ek DNA replikasyonu yoluyla verimi arttırmak için, primerleri yeniden aktive etmek ve diğer DNA ipliklerine bağlanmalarına izin vermek için reaksiyon tekrar soğutulur.

Daha sonra reaksiyonun yeniden ısıtılması polimeraz enzimini tekrar aktive eder ve daha fazla kopya üretilir. Bu döngü 25 ila 30 kez tekrarlanabilir.

Plazmit vektör yöntemi, kesmek ve plazmitlere yerleştirmek için bol miktarda ilk DNA kaynağına dayanır. Çok az orijinal DNA, daha az plazmitle sonuçlanır ve klonlanmış DNA üretimi yavaş başlar.

PCR yöntemi, birkaç orijinal DNA dizisinden büyük miktarda DNA üretebilir, ancak DNA bir bakteri hücresine implante edilmediğinden protein üretimi mümkün değildir.

Küçük bir ilk DNA örneğinden klonlanacak DNA fragmanlarında kodlanmış proteini üretmek için iki yöntem birlikte kullanılabilir ve bunlar birbirini tamamlar. İlk olarak, küçük bir örnekten DNA klonlamak ve birçok kopya üretmek için PCR yöntemi kullanılır.

Daha sonra PCR ürünleri, üretilen DNA'yı, istenen proteini üretecek bakteri hücrelerine implante etmek için plazmit vektör yöntemiyle kullanılır.

Moleküler biyoloji, tıbbi ve ticari amaçlar için gen klonlama ve DNA replikasyonu kullanır. Klonlanmış DNA dizilerine sahip bakteriler, ilaç üretmek ve genetik bozukluğu olan kişilerin kendi üretemeyecekleri maddelerin yerini almak için kullanılıyor.

Tipik kullanımlar şunları içerir:

• için gen insan insülini şeker hastaları tarafından kullanılan insülini üreten bakterilerde klonlanır.
• Doku plazminojen aktivatörü, klonlanmış DNA'dan üretilir ve yardımcı olmak için kullanılır. kan pıhtılarını önlemek.
• İnsan büyüme hormonu kendisi üretemeyen insanlara üretilebilir ve yönetilebilir.

Biyoteknoloji, bitkilerde ve hayvanlarda yeni özellikler yaratmak veya mevcut özellikleri geliştirmek için tarımda gen klonlamasını da kullanır. Daha fazla gen klonlandıkça, olası kullanımların sayısı katlanarak artar.

DNA molekülleri, canlı bir hücredeki maddenin küçük bir bölümünü oluşturur ve birçok genin etkilerini izole etmek zordur. DNA klonlama yöntemleri, çalışma için büyük miktarlarda belirli bir DNA dizisi sağlar ve DNA, orijinal hücrede olduğu gibi proteinler üretir. DNA klonlama, bu işlemin farklı genler için izolasyonda çalışılmasını mümkün kılar.

Tipik araştırma ve DNA teknolojisi uygulamaları şunları içerir:

• Bir genin işlevi.
• Bir genin mutasyonları.
• Gen ifadesi.
• Gen ürünleri.
• Genetik kusurlar.

Daha fazla DNA dizisi klonlandığında, ek dizileri bulmak ve klonlamak daha kolaydır. Mevcut klonlanmış DNA segmentleri, yeni bir segmentin eskisiyle eşleşip eşleşmediğini ve hangi parçaların farklı olduğunu belirlemek için kullanılabilir. Hedef DNA dizisini belirlemek daha hızlı ve daha doğrudur.

İçinde gen tedavisi, doğal geni zarar görmüş bir organizmanın hücrelerine klonlanmış bir gen sunulur. Belirli bir organizma işlevi için gerekli olan bir proteini üreten hayati bir gen mutasyona uğrayabilir, radyasyonla değiştirilebilir veya virüslerden etkilenebilir.

Gen düzgün çalışmadığında, hücreden önemli bir madde eksik olur. Gen tedavisi denenir geni, gerekli maddeyi üretecek klonlanmış bir versiyonla değiştirin.

Gen tedavisi hala deneyseldir ve bu teknik kullanılarak çok az hasta tedavi edilmiştir. Sorunlar, tıbbi bir durumdan sorumlu olan tek geni belirlemek ve genin birçok kopyasını doğru hücrelere iletmekle ilgilidir. DNA klonlama daha yaygın hale geldikçe, gen tedavisi birkaç özel durumda uygulandı.

Son başarılı uygulamalar şunları içeriyor:

• Parkinson hastalığı: Vektör olarak bir virüs kullanılarak, Parkinson hastalığı ile ilgili bir gen, hastaların orta beyinlerine enjekte edildi. Hastalar, herhangi bir olumsuz yan etki olmaksızın gelişmiş motor beceriler yaşadılar.
• Adenozin deaminaz (ADA) eksikliği: Genetik bir bağışıklık bozukluğu, hastaların kan kök hücrelerinin çıkarılması ve ADA geninin eklenmesiyle tedavi edildi. Sonuç olarak hastalar kendi ADA'larının en azından bir kısmını üretebildiler.
• Hemofili: Hemofili hastaları kanın pıhtılaşmasına yardımcı olan spesifik proteinler üretmezler. Eksik proteinlerden birinin üretimi için bir gen, hastaların karaciğer hücrelerine yerleştirildi. Hastalar protein üretti ve kanama olayları azaldı.

Gen tedavisi, DNA klonlamanın en umut verici uygulamalarından biridir, ancak daha fazla DNA dizisi çalışıldıkça ve işlevleri belirlendikçe diğer yeni kullanımların artması muhtemeldir. DNA klonlama, genetik mühendisliği için gereken miktarlarda hammadde sağlar.

Genlerin rolü bilindiğinde ve kusurlu genlerin değiştirilmesi yoluyla düzgün işlevleri garanti edilebildiğinde. genler, birçok kronik hastalık ve hatta kanser, DNA kullanılarak genetik düzeyde saldırıya uğrayabilir ve tedavi edilebilir. teknoloji.

İlgili içerik:

• E.Coli'nin (Escherichia Coli) Koloni Özellikleri
• RNA: Tanımı, İşlevi, Yapısı