Western Blot'un Avantajları ve Dezavantajları

Western blot, belirli bir numunede belirli bir proteini saptamak için kullanılan analitik bir tekniktir, bir enzimin veya floresan etiketli birincil antikorun kendi spesifik antijenine bağlanma yeteneğini kullanır. Jel elektroforezi ile başlayan, ardından membran blotlama ve antikorlarla sondalama ile başlayan üç aşamalı bir işlemdir. Protein tespiti, doğrudan veya dolaylı olabilir; ikincisi, birincile karşı yönlendirilmiş bir etiketli ikincil antikor kullanır. Rutin bir protein analiz tekniği olarak kabul edilmesine rağmen, western blot'un faydaları olduğu kadar sınırlamaları da vardır.

Western blot lehine en büyük argümanlardan biri duyarlılığıdır. Bir numunede 0,1 nanogram kadar az protein tespit etme kabiliyeti nedeniyle, teknik teorik olarak şu şekilde hizmet edebilir: bir hastadaki bir virüs veya bakteriden gelen en küçük immünojenik yanıtı bile algılayan etkili bir erken teşhis aracı örneklem. Dolaylı bir western blot, ikincil antikorun görüntüleme sistemi tarafından tespit edilen sinyalin yoğunluğunu yükseltme yeteneğinden gelen bu duyarlılığı daha da geliştirir. Daha yüksek hassasiyet, test için daha az antikora ihtiyaç duyulduğu anlamına gelir ve bu da laboratuvar maliyetlerini önemli ölçüde azaltır.

Western blot tekniği, özgünlüğünü iki büyük katkıda bulunan faktöre borçludur. İlk olarak jel elektroforezi, bir numuneyi farklı boyut, yük ve konformasyondaki proteinlere ayırır. Jelde oluşan bantlar, ilgilenilen proteinin veya polipeptidin boyutu hakkında zaten ipuçları verdiğinden, bu süreç kendi başına saptamaya yönelik büyük bir adımdır. Antikor-antijen etkileşiminin özgüllüğü ikinci büyük faktör olarak hizmet eder. Spesifik antikorlar, spesifik proteinler için afinite gösterdiğinden, proses, 300.000 farklı protein karışımında bile bir hedef proteini seçici olarak tespit edebilir.

Duyarlılığına ve özgüllüğüne rağmen, bir western blot yine de hatalı sonuçlar üretebilir. Bir antikor amaçlanmayan bir proteinle reaksiyona girdiğinde yanlış pozitif sonuç verir; HIV testi yapılan bir hastada tüberküloz veya bir dizi parazit olması durumunda ortaya çıkar. enfeksiyonlar. Öte yandan, daha büyük proteinlere zara düzgün bir şekilde transfer etmek için yeterli zaman verilmezse, yanlış negatiflik kolayca ortaya çıkabilir. Uygun olmayan blotlama ve işleme genellikle eğri, soluk ve hatta çoklu bantlar üreterek test sonuçlarını teknisyenin yorumuna tabi kılar.

Western blot maliyeti, etiketlenmiş antikorlar, yetenekli analistler ve laboratuvar ekipmanı için büyük bireysel harcamaların bir bileşimidir. Hassas bir süreç olan western blot, bir numunenin bileşenlerinin doğru bir şekilde tanımlanması için her adımda hassasiyet gerektirir. Reaktif konsantrasyonundaki veya inkübasyon periyodundaki küçük bir hata, tüm süreç için felaket olabilir. Son olarak, algılama ve görüntüleme için gerekli ekipman – kemilüminesan, floresan, radyoaktif veya lazer algılama sistemleri – ortalama bir mikrobiyoloji birimi için çok pahalı olabilir.