Yapışkan Uçlu Enzimleri Kullanmanın Avantajları

Moleküler klonlama, her öğrencinin ve araştırmacının aşina olması gereken yaygın bir biyoteknoloji yöntemidir. İnsan DNA'sını daha sonra bir bakteri hücresinin plazmit DNA'sına eklenebilecek parçalara ayırmak için kısıtlama enzimi adı verilen bir enzim türü kullanılarak moleküler klonlama. Kısıtlama enzimleri, çift sarmallı DNA'yı ikiye böler. Kısıtlama enzimine bağlı olarak, kesim ya yapışkan bir uç ya da kör bir uç ile sonuçlanabilir. Yapışkan uçlar moleküler klonlamada daha kullanışlıdır çünkü insan DNA fragmanının plazmide doğru yönde yerleştirilmesini sağlarlar. DNA parçalarının ligasyon işlemi veya kaynaşması, DNA'nın yapışkan uçları olduğunda daha az DNA gerektirir. Son olarak, birden fazla yapışkan uç kısıtlama enzimi, her enzim farklı bir kısıtlama dizisini tanımasına rağmen aynı yapışkan ucu üretebilir. Bu, ilgilendiğiniz DNA bölgesinin yapışkan uç enzimleri tarafından kesilip çıkarılma olasılığını artırır.

Kısıtlama enzimleri, çift sarmallı DNA'daki belirli dizileri tanıyan ve bu dizide DNA'yı yarıya indiren enzimlerdir. Tanınan diziye kısıtlama bölgesi denir. Kısıtlama enzimleri, çift sarmallı DNA'yı, yani DNA'nın normalde var olduğu şekilde, DNA'nın uçları arasındaki yerlerde kestikleri için endonükleazlar olarak adlandırılır. 90'dan fazla farklı restriksiyon enzimi vardır. Her biri ayrı bir kısıtlama bölgesi tanır. Kısıtlama enzimleri, ilgili kısıtlama bölgelerini tanımadıkları diğer bölgelere göre 5.000 kat daha verimli bir şekilde bölerler.

Kısıtlama enzimleri iki genel sınıfa ayrılır. DNA'yı ya yapışkan uçlara ya da kör uçlara bölerler. Yapışkan bir uç, eşlenmemiş, DNA'nın yapı taşları olan kısa bir nükleotid bölgesine sahiptir. Bu eşleştirilmemiş bölgeye çıkıntı denir. Çıkıntının yapışkan olduğu söylenir çünkü tamamlayıcı çıkıntı dizisine sahip başka bir yapışkan uçla eşleşmek ister ve onunla eşleşmek ister. Yapışkan uçlar, karşılaştıklarında birbirlerine sıkıca sarılmak isteyen uzun süredir kayıp ikizler gibidir. Öte yandan, kör uçlar yapışkan değildir, çünkü tüm nükleotidler zaten iki DNA dizisi arasında eşleştirilmiştir. Yapışkan uçların avantajı, insan DNA'sının bir parçasının bir bakteri plazmidine yalnızca bir yönde sığabilmesidir. Buna karşılık, hem insan DNA'sı hem de bakteri plazmidi küt uçlara sahipse, insan DNA'sı plazmide baştan sona veya kuyruktan başa eklenebilir.

Çubuk uçlu DNA'nın "yapışkanlıkları" nedeniyle birbirlerini bulmaları daha kolay olsa da, ne yapışkan uçlar ne de kör uçlar sürekli bir DNA parçası halinde birleşemez. Tamamen bağlı olan sürekli bir DNA parçasının oluşumu, ligaz adı verilen bir enzim gerektirir. Ligazlar, nükleotitlerin omurgalarını yapışkan veya kör uçlarda birbirine bağlayarak sürekli bir nükleotit zincirine neden olur. Yapışkan uçlar, birbirlerine olan çekimleri nedeniyle birbirlerini daha hızlı buldukları için, ligasyon işlemi daha az insan DNA'sı ve daha az plazmit DNA'sı gerektirir. DNA ve plazmitlerin kör uçlarının birbirini bulması daha az olasıdır ve bu nedenle kör uçların bağlanması, test tüpüne daha fazla DNA konulmasını gerektirir.

Kısıtlama bölgeleri, organizmaların genomu boyunca yer alır, ancak eşit aralıklı değildir. Plazmitlerde, yan yana yerleştirilecek şekilde tasarlanabilirler. İnsan genomundan insan DNA'sının bir parçasını kesmek isteyen bilim adamları, parça bölgesinin önünde ve arkasında bulunan kısıtlama bölgeleri bulmalıdır. Bir DNA parçasının doğru yönde yerleştirilmesini sağlamanın yanı sıra, farklı yapışkan uç enzimleri, farklı kısıtlama dizilerini tanısalar bile aynı yapışkan ucu oluşturabilir. Örneğin, BamHI, BglII ve Sau3A farklı tanıma dizilerine sahiptir ancak aynı GATC yapışkan ucunu üretir. Bu, ilgilendiğiniz insan geninizi çevreleyen yapışkan uç kısıtlama sitelerinin olma olasılığını artırır.