DNA'yı dizilemeden veya genetik mühendisliği yoluyla değiştirmeden önce, bilim adamları önce onu izole etmelidir. Hücreler proteinler, yağlar, şekerler ve küçük moleküller gibi çok çeşitli başka bileşikler içerdiğinden, bu zor bir görev gibi görünebilir. Neyse ki biyologlar, DNA'yı bu kirleticilerden ayırmak ve onu daha fazla çalışma için hazırlamak için DNA'nın kimyasal özelliklerini kullanabilirler. Bu işleme DNA ekstraksiyonu denir.
Hücre Lizizi
DNA ekstraksiyonu için kullanılan birçok farklı teknik vardır. Bireysel bir laboratuvar tarafından kullanılan, yapılacak deneyin türüne ve DNA'nın ne kadar saf olması gerektiğine bağlıdır. Bilim adamları genellikle hücreleri içeren bir örnekle (örneğin bir doku veya kan örneği) başlar ve hücreleri kırarak açar veya onları parçalar. Hücreleri parçalamanın çeşitli yolları vardır. Deterjan eklemek, onları yüksek frekanslı ses dalgalarına maruz bırakacağı gibi, ayrılmalarına neden olur. Alternatif olarak, numuneyi cam boncuklarla karıştırmak ve hızlı bir şekilde titretmek, hücreleri fiziksel olarak parçalayacak ve içeriklerini serbest bırakacaktır.
Hızlı ve Kirli Yaklaşımlar
Yüksek saflık gerekli değilse, bilim adamları numunedeki proteinlerin çoğunu parçalamak için proteinaz K adlı bir enzim ekleyebilir ve ardından olduğu gibi kullanabilirler. Ancak bu teknik çok kirlidir, çünkü kirleticilerin çoğu hala mevcut olduğundan, yalnızca hız bir öncelikse ve saflık sorun değilse uygundur. Bir başka hızlı ve kirli yaklaşım, proteinleri çökelmeye zorlamak için amonyum veya potasyum asetat gibi tuzlar ekleyerek tuz konsantrasyonunu artırarak proteinleri uzaklaştırmaktır. Bu teknik de oldukça kirli çünkü diğer birçok kirletici hala mevcut.
Fenol-Kloroform Ekstraksiyonu
Diğer bir yaklaşım, hücreleri deterjanla parçalamak ve ardından solüsyonu izoamil alkol, kloroform ve fenol ile karıştırmaktır. Çözelti daha sonra iki katmana ayrılır. Proteinler üst organik katmanda sonlanırken, DNA alt sulu katmanda kalır. Bu teknik, iyi sonuçlar için tuz konsantrasyonunun ve pH'ın dikkatli kontrolünü gerektirir. Zaman alıcıdır ve hem fenol hem de kloroform oldukça zehirli kimyasallardır. Sonuç olarak, fenol-kloroform ekstraksiyonları bir zamanlar rutin iken, son yıllarda diğer teknikler daha popüler hale geldi.
Anyon Değişim Kromatografisi
Anyon değişim kromatografisi, fenol-kloroform ekstraksiyonundan daha yüksek saflık ve daha tutarlı sonuçlar sunar. Bir tüp veya kolon, üzerlerinde negatif yüklü bir molekül veya anyonun bağlanabileceği pozitif yüklü bölgelere sahip küçük parçacıklarla doludur. Proteinler ve RNA gibi diğer kirleticiler kolondan yıkanırken DNA bu anyon değişim bölgelerine bağlanır. Daha sonra, DNA'yı kolondan çıkarmak için tuz açısından zengin bir çözelti kullanılır.
Kitler
DNA'yı saflaştırmanın en hızlı ve belki de en güvenilir tekniği, özel olarak üretilmiş bir kitin kullanılmasıdır. Bu kitler, bir tüp içinde silika jel membranlar içerir. DNA, zara yapışırken, diğer kirleticiler, kit ile birlikte gelen bir dizi özel hazırlanmış tuz solüsyonu kullanılarak yıkanır. Son olarak DNA, kolondan düşük tuzlu bir solüsyonla yıkanır. Bu kitler hızlıdır, kullanımı kolaydır ve tekrarlanabilir sonuçlar sunar.
absorbans
DNA izole edildikten ve pH kontrollü bir tampon çözeltisi içinde yeniden süspanse edildikten sonra, son adım saflığını test etmektir. Bunu yapmanın kolay ve kullanışlı bir yolu, 260 ve 280 nanometre dalga boylarında ne kadar ultraviyole ışığı emdiğini kontrol etmektir. 260 nanometrede absorpsiyon bölü 280 nanometrede absorpsiyon, DNA saf ise 1.8'e eşit olmalıdır. 260 nanometrede absorbansı ölçmek ayrıca DNA'nın konsantrasyonunu belirlemenizi sağlar.
