Western blot, biyokimyasal laboratuvarlarda en yaygın prosedürlerden biridir. Temel olarak, proteinleri bir numuneden boyutlarına göre ayırır, ardından belirli bir proteinin mevcut olup olmadığını belirlemek için antikorları kullanarak test eder. Yalnızca araştırmalarda değil, aynı zamanda tıbbi veya teşhis laboratuvarlarında da yararlıdır; örneğin hem HIV hem de Lyme hastalığı için testler, enzime bağlı immünosorbent tahlili (ELISA) testini ve ardından ELISA testleri pozitifse Western blot'u içerir. Bununla birlikte, popülaritesine rağmen, Western blotlamanın birkaç dezavantajı vardır.
niceliksel olmayan
Klasik Western lekeleri niceliksel değildir. Başka bir deyişle, araştırmacılara belirli bir proteinin mevcut olup olmadığını söyleyebilseler de, proteinin ne kadarının bulunduğunu ölçmeyi mümkün kılmazlar. Bazı biyoteknoloji şirketleri artık araştırmacıların veya laboratuvar teknisyenlerinin biyoteknolojinin miktarını belirlemesini sağlayan kitler satıyor. standart bir eğri kullanılarak mevcut protein - ancak bu yalnızca aynı proteinin saf örnekleri mevcut. Ayrıca, bir proteinin moleküler ağırlığı, kütle spektrometrisiyle olduğu gibi kesin olarak belirlenmek yerine, yalnızca Western blot ile tahmin edilebilir.
antikorlar
Western blot, yalnızca ilgilenilen proteine karşı birincil antikorlar mevcutsa gerçekleştirilebilir. Biyoteknoloji şirketlerinde pek çok farklı protein için antikorlar bulunsa da, bunlar ucuz değil; belirli bir protein için birincil antikorlar mevcut değilse, o belirli proteini arayan bir Western blot gerçekleştirmek mümkün olmayacaktır. Ayrıca araştırmacılar, bir proteinin bir şekilde değiştirilip değiştirilmediğini - fosforile edilmişse (bir proteine sahipse) belirlemek isteyebilir. ona bağlı fosfat grubu), örneğin - ve Western blot tekniğiyle, modifiye edilmiş gruba özgü antikorlara ihtiyaç duyarlar. protein.
Eğitim
Western blot'u düzgün bir şekilde yapmak ve iyi sonuçlar almak zor olabilir, bu nedenle personelin iyi eğitimli olması gerekir. Pek çok konuda olduğu gibi bunda da deneyim belki de en iyi öğreticidir; Ancak deneyimli bir teknisyen için bile Western blot zaman alıcıdır. Örneğin, deneyin jel elektroforezi bölümünün yürütülmesi tipik olarak bir ila iki saat sürer. Elbette, jel çalışırken diğer görevler gerçekleştirilebilir, ancak deneyin sonuç alması yine de oldukça uzun zaman alır.
Diğer Sınırlamalar
Antikorlar bazen daha kötü sonuçlara yol açabilecek bazı hedef dışı bağlanma sergileyebilir. Üstelik Western blotlama ile belirli bir proteine karşı bir antikor kullanırsınız, bu nedenle sonuçlarınız size yalnızca o proteinin mevcut olup olmadığını söyleyecektir. Yüksek çözünürlüklü kütle spektrometrisi, aksine, bir numunede bulunan tüm proteinleri ortaya çıkarır ve klasik Western blotlamanın aksine niceldir. Elbette, kütle spektrometrisinin Western blot ile karşılaştırıldığında çok daha pahalı ve teknik olarak daha zor olduğunu hatırlamak önemlidir.