Yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) ile çalışırken, güvenilir ve kaliteli sonuçlar elde etmek için iyi kalibrasyon kesinlikle gereklidir. Bir HPLC cihazının uygun kalibrasyonu, uygun bir kalibrasyon standardının yapılmasıyla başlar. Çoğu durumda, kalibrasyon aslında bir kalibrasyon eğrisi olarak bilinen şeyi üretmek için bir dizi artan konsantrasyon standardı gerektirir. Bu, test edilen kimyasalın konsantrasyonu ile HPLC detektörünün yanıtı arasındaki ilişkiyi açıklayan çizilmiş bir çizgi ve ilgili denklemdir.
HPLC ("analit") kullanarak test etmek istediğiniz kimyasalı belirleyin. Örneğin, fruktoz içeriği için bir dizi alkolsüz içeceği test etmek isteyebilirsiniz, bu durumda fruktoz analit olacaktır.
Uygun saflıkta bir miktar analit kimyasalı elde edin. Normalde saflık %99'un üzerinde olmalı ve analit saygın bir kimyasal tedarik şirketinden satın alınmalıdır. Örneğin fruktoz söz konusu olduğunda, bir bakkaldan değil, bir kimyasal satıcıdan saf fruktoz satın alırsınız.
HPLC üzerinde test etmeyi düşündüğünüz numunelerdeki analitin maksimum ve minimum beklenen konsantrasyonlarını belirleyin. Alkolsüz içecekler söz konusu olduğunda, içeceklerin etiketlerini inceleyerek test edeceğiniz içecekler arasında en düşük ve en yüksek fruktoz içeriğini belirlersiniz. İlk numunenin (meşrubat) analize hazırlanırken seyreltilebileceğini veya başka şekilde manipüle edilebileceğini unutmayın. (kullanılan HPLC yöntemine bağlı olarak) ve dolayısıyla HPLC'ye fiilen enjekte edilen numunelerdeki analit konsantrasyonu, değiştirilmiş. Göz önünde bulundurulması gereken, HPLC'de çalıştırıldığı şekliyle numunelerdeki analit konsantrasyonudur.
Kalibrasyon standartlarını oluşturmak için analitinizi çözeceğiniz çözücüyü belirleyin. Bu solvent, analiti nispeten geniş bir konsantrasyon aralığında (en azından test etmeyi düşündüğünüz numunelerdeki kadar yüksek) uygun şekilde çözebilmelidir. Ayrıca, bu çözücü ideal olarak "mobil faz"a oldukça benzer olmalıdır: HPLC cihazı aracılığıyla numuneleri taşımak için kullanılan çözücü.
Analitin "stok standart" çözeltisini yapmak için gereken analit miktarını hesaplayın. Bu, stok standardının gerekli konsantrasyonunun istenen hacimle çarpılmasıyla bulunur. Bu çözeltideki analitin konsantrasyonu, beklenen en yüksek numune konsantrasyonundan en az %10 daha yüksek olmalıdır. Bir meşrubat numunesinde beklenen en yüksek fruktoz konsantrasyonu 8 gram/100 mililitre ise, o zaman stok standardı 10 gram fruktoz/100 mililitre konsantrasyonuna yapılabilir. Makul bir hacim 500 mililitredir, bu nedenle 8/100 mL x 500 mL = 40 gram fruktoz gerekecektir.
Gerekli miktarda analiti uygun bir hassasiyet düzeyine kadar tartın. Genellikle bir veya iki ondalık basamağa kadar hassas gram cinsinden bir ağırlık değeri uygundur, ancak bazı yöntemler için daha fazla hassasiyet gerekebilir.
Tartılan analiti gerekli hacimde bir ölçülü balona aktarın ve balondaki dolum işaretine istenen çözücüyü ekleyin. Hacimli bir şişenin kullanılması (örneğin dereceli bir beher yerine), stok standart konsantrasyon değerinin kesinliğini arttırır. Tüm analitin şişeye aktarıldığından emin olun; gerekirse, yıkamak için çözücünün bir kısmını kullanın.
Stok standardının bilinen hacimlerini ölçülü balonlara aktararak, doğru transfer için pipetler kullanarak ve ardından solvent ekleyerek stok standardının bir dizi değişen seyreltmelerini yapın. En düşük standart konsantrasyon, analiz edilecek en düşük beklenen numunenin altında olmalıdır. Meşrubat örneğinde, bir numunede beklenen en düşük fruktoz konsantrasyonu 2 gram/100 mL ise, 1 gram/100 mL standart yapılabilir. Bu, stok standardının on kat seyreltilmesiyle yapılacaktır. Standart seri toplam 5 veya 6 konsantrasyon içermelidir, bu nedenle belki 3, 5 ve 8 gram fruktoz/mL standartlar üretmek için ek seyreltmeler gerekli olacaktır. Artık HPLC'yi kalibre etmek için bir dizi standart çözümünüz var.