Kemister använder högpresterande vätskekromatografi eller HPLC för att separera blandningar av föreningar. I allmänhet består metoden av att injicera ett prov i en kolonn där det blandas med ett eller flera lösningsmedel. Olika föreningar adsorberar, eller ”fäster”, i kolumnen i olika grader; och när lösningsmedlet skjuter föreningarna genom kolonnen kommer en av blandningskomponenterna att lämna kolonnen först. Instrumentet detekterar föreningarna när de lämnar kolonnen och producerar ett kromatogram som består av en plot med retentionstid på x-axeln och signalintensitet från detektorn på y-axeln. När föreningarna lämnar kolonnen producerar de "toppar" i kromatogrammet. I allmänhet, ju längre bort från varandra och ju smalare topparna i kromatogrammet, desto högre upplösning. Forskare anser att en upplösning på 1.0 eller högre representerar en adekvat separation.
Mät bredden på två intilliggande toppar i kromatogrammet genom att notera var x-axelvärdena ligger vid basen av varje topp. X-axeln representerar retentionstid, vanligtvis mätt i sekunder. Således, om en topp börjar vid 15,1 sekunder och slutar vid 18,5 sekunder, är dess bredd (18,5 - 15,1) = 3,4 sekunder.
Bestäm retentionstiderna genom att notera tiden, dvs. platsen på x-axeln, som motsvarar platserna för maxima för topparna. Detta värde ligger normalt ungefär halvvägs mellan de två värden som används för att beräkna bredden i steg 1. Exemplet i steg 1 skulle exempelvis uppvisa ett maximum vid cirka 16,8 sekunder.
Beräkna upplösningen, R, mellan två toppar med:
R = \ frac {RT_1-RT_2} {0.5 (W_1 + W_2)}
där RT1 och RT2 representerar retentionstiderna för topparna 1 och 2 och W1 och W2 representerar bredden på topparna som tas vid deras baser. Fortsätter exemplet från steg 2 och 3 uppvisar en topp en retentionstid på 16,8 sekunder och en bredd på 3,4 sekunder. Om den andra toppen uppvisade en retentionstid på 21,4 sekunder med en bredd på 3,6 sekunder skulle upplösningen vara:
R = \ frac {21.4-16.8} {0.5 (3.4 + 3.6)} = 1.3
Saker du behöver
- HPLC-kromatogram
- Kalkylator
