Polymeraskedjereaktion, eller PCR, är en teknik som kopierar ett DNA-fragment i många fragment - exponentiellt många. Det första steget är i PCR är att värma DNA så att det denaturerar eller smälter i enstaka strängar. DNA-strukturen är som en repstege där stegpinnarna är rep med magnetiska ändar. Magneterna ansluter för att bilda steg, så kallade baspar, och motstår sålunda att dras isär. Varje DNA-fragment smälter i enstaka strängar vid olika temperaturer. Att förstå hur DNA-strukturen hålls samman av DNA: s enskilda delar kommer att ge inblick i varför olika DNA-fragment smälter vid olika temperaturer och varför så höga temperaturer behövs först plats.
Smältande! Smältande!
Det första steget i PCR är att smälta DNA så att dubbelsträngat DNA separeras i enkelsträngat DNA. För däggdjurs-DNA involverar detta första steg vanligtvis värme på cirka 95 grader Celcius (cirka 200 Fahrenheit). Vid denna temperatur bryts vätebindningarna mellan A-T- och G-C-basparen, eller steg i DNA-stegen, sönder, varvid dubbelsträngat DNA lossas. Emellertid är temperaturen inte tillräckligt varm för att bryta fosfat-socker-ryggraden som bildar de enskilda trådarna eller stegen. Fullständig separering av enskilda strängar förbereder dem för det andra steget av PCR, som kyler för att tillåta korta DNA-fragment, kallade primrar, att binda de enskilda strängarna.
Magnetiska blixtlås
En anledning till att DNA värms upp till den höga temperaturen på 95 grader Celcius är att ju längre DNA-dubbelsträngen är, desto mer vill den vara tillsammans. DNA-längd är en faktor som påverkar den smältpunkt som valts för PCR på den biten DNA. A-T- och G-C-basparen i den dubbelsträngade DNA-bindningen med varandra för att hålla dubbelsträngstrukturen samman. Ju fler på varandra följande baspar mellan två enkelsträngar har bundits, desto mer vill deras grannar också binda, och desto starkare blir attraktionen mellan de två trådarna. Det är som en dragkedja gjord av små magneter. När du stänger dragkedjan, vill magneterna naturligtvis vilja blixtlås och förbli blixtlås.
Starkare magneter fäster tätare
En annan faktor som påverkar vilken smälttemperatur du ska välja för ditt DNA-fragment av intresse är mängden GC-baspar som finns i det fragmentet. Varje baspar är som två mini-magneter som lockar. Ett par av G och C lockas mycket starkare än ett A- och T-par. Således kommer en bit DNA som har fler GC-par än ett annat fragment att kräva en högre temperatur innan den smälter i enstaka strängar. DNA absorberar naturligt ultraviolett ljus - med en våglängd på 260 nanometer, för att vara exakt - och enkelsträngat DNA absorberar mer ljus än dubbelsträngat DNA. Så att mäta mängden absorberat ljus är ett sätt att mäta hur mycket ditt dubbelsträngade DNA har smält till enstaka strängar. Den "magnetiska dragkedjan" -effekten av GC- och AT-baspar är det som orsakar ett diagram över ljusabsorbansen hos dubbelsträngat DNA ritat mot en ökning av temperaturen för att vara sigmoidal, formad som en S och inte en rak linje. S-kurvan representerar lagmotståndsmotståndet som basparet utövar mot värmen eftersom de inte vill separera.
Halfway Point
Temperaturen vid vilken en längd av DNA smälter i enstaka strängar kallas dess smälttemperatur, vilket betecknas med förkortningen "Tm." Detta indikerar temperaturen vid vilken hälften av DNA: t i en lösning har smält till enstaka strängar och den andra halvan är fortfarande i dubbelsträng form. Smältningstemperaturen är olika för varje fragment av DNA. Däggdjurs-DNA har ett G-C-innehåll på 40%, vilket innebär att de återstående 60% av basparna är As och Ts. Dess 40% G-C-innehåll gör att däggdjurs-DNA smälter vid 87 ° C (cirka 189 Fahrenheit). Det är därför det första steget med PCR på däggdjurs-DNA är att värma upp det till 94 grader Celcius (201 Fahrenheit). Bara sju grader varmare än smälttemperaturen och alla dubbla strängar smälter helt till enstaka trådar.