Молекуларно клонирање је уобичајена биотехнолошка метода са којом би сваки студент и истраживач требало да буде упознат. Молекуларно клонирање помоћу врсте ензима која се назива рестрикциони ензим за сечење људске ДНК на фрагменте који се затим могу убацити у плазмидну ДНК бактеријске ћелије. Рестрикцијски ензими преполовљују дволанчану ДНК. У зависности од рестрикционог ензима, рез може резултирати лепљивим или тупим крајем. Лепљиви крајеви су кориснији у молекуларном клонирању јер обезбеђују да се фрагмент људске ДНК убаци у плазмид у правом смеру. Процес лигације или стапање фрагмената ДНК захтева мање ДНК када ДНК има лепљиве крајеве. И на крају, вишеструки лепљиви рестрикциони ензими могу произвести исти лепљиви крај, иако сваки ензим препознаје другачију рестрикциону секвенцу. Ово повећава вероватноћу да ваш ДНК регион од интереса може бити исечен лепљивим крајњим ензимима.
Рестрикцијски ензими и места за ограничење
Рестриктивни ензими су ензими који пресецају препознају специфичне секвенце на дволанчаној ДНК и секу ДНК на пола у тој секвенци. Препозната секвенца назива се рестрикционо место. Рестриктивни ензими се називају ендонуклеазама, јер пресецају дволанчану ДНК, како ДНК иначе постоји, на местима која се налазе између крајева ДНК. Постоји више од 90 различитих рестрикционих ензима. Свака препознаје посебно место ограничења. Рестриктивни ензими цепају своја одговарајућа рестрикциона места 5000 пута ефикасније од других места која не препознају.
Права оријентација
Рестрикцијски ензими постоје у две опште класе. Или ДНК пресеку на лепљиве крајеве или на тупе крајеве. Лепљиви крај има кратку регију нуклеотида, градивних блокова ДНК, која није упарена. Ова неспарена регија назива се надвишењем. Каже се да је превис лепљив јер жели и удружиће се са другим лепљивим крајем који има комплементарни низ надвишења. Лепљиви крајеви су попут давно изгубљених близанаца који желе да се чврсто загрле након што се сретну. С друге стране, тупи крајеви нису лепљиви, јер су сви нуклеотиди већ упарени између два ланца ДНК. Предност лепљивих крајева је у томе што се фрагмент људске ДНК може уклопити у бактеријски плазмид само у једном смеру. Супротно томе, ако и људска ДНК и бактеријски плазмид имају тупе крајеве, људска ДНК се може убацити глава-у-реп или реп-у-главу у плазмид.
За повезивање лепљивих завршетака потребно је мање ДНК
Иако се ДНК са крајевима штапића лакше проналазе због своје „лепљивости“, нити лепљиви крајеви нити тупи крајеви не могу се спојити у непрекидни комад ДНК. За стварање континуираног дела ДНК који је потпуно повезан потребан је ензим који се назива лигаза. Лигазе повезују окосницу нуклеотида на лепљивим или тупим крајевима, што резултира континуираним ланцем нуклеотида. Пошто се лепљиви крајеви брже проналазе због међусобне привлачности, процес лигације захтева мање људске ДНК и мање плазмидне ДНК. Тупи крајеви ДНК и плазмиди имају мању вероватноћу да се пронађу, па стога лигација тупих крајева захтева да се у епрувету стави више ДНК.
Различити ензими могу дати исти лепљиви крај
Рестрикциона места се налазе у целом геному организама, али нису равномерно распоређена. У плазмидима се могу конструисати тако да се налазе непосредно један поред другог. Научници који желе да исеку фрагмент људске ДНК из људског генома морају да пронађу места ограничавања која се налазе испред и иза региона фрагмента. Поред тога што осигуравају да је фрагмент ДНК уметнут у правом смеру, различити лепљиви крајњи ензими могу створити исти лепљиви крај иако препознају различите рестрикционе секвенце. На пример, БамХИ, БглИИ и Сау3А имају различите секвенце препознавања, али производе исти ГАТЦ лепљиви крај. Ово повећава вероватноћу да ће постојати лепљива крајња места за ограничавање која бочно прате ваш људски ген од интереса.