Како се узорак ДНК прикупља и припрема за проучавање

Пре него што могу секвенцирати ДНК или је изменити генетским инжењерингом, научници је прво морају изоловати. Ово може изгледати тежак задатак, јер ћелије садрже широк спектар других једињења попут протеина, масти, шећера и малих молекула. Срећом, биолози могу да користе хемијска својства ДНК да одвоје ДНК од ових загађивача и припреме је за даља проучавања. Овај процес се назива екстракција ДНК.

Лиза ћелија

Постоји много различитих техника које се користе за екстракцију ДНК. Она коју користи појединачна лабораторија зависи од врсте експеримента који треба извести и од тога колико ДНК мора бити чиста. Научници углавном започињу узорком који садржи ћелије - на пример узорак ткива или крви - и разбијају ћелије или их лизирају. Постоје различити начини на које можете лизирати ћелије. Додавање детерџента проузроковаће њихово раздвајање, као и излагање високофреквентним звучним таласима. Алтернативно, мешање узорка са стакленим куглицама и његово брзо вибрирање ће физички разбити ћелије и ослободити њихов садржај.

Брзи и прљави приступи

Ако није потребна висока чистоћа, научници могу да додају ензим зван протеиназа К да разложе већину протеина у узорку, а затим га користе онаквог какав јесте. Ова техника је међутим врло прљава, с обзиром да је већина загађивача и даље присутна, па је погодна само ако је брзина приоритет и чистоћа није проблем. Још један брз и прљав приступ је уклањање протеина повећањем концентрације соли додавањем соли попут амонијума или калијум ацетата да би се протеини таложили. И ова техника је прилично прљава, јер су и даље присутни многи други загађивачи.

Екстракција фенол-хлороформом

Други приступ је лизирање ћелија детерџентом, а затим раствор помешати са изоамил алкохолом, хлороформом и фенолом. Затим се раствор раздваја у два слоја. Протеини завршавају у горњем органском слоју, док ДНК остаје у доњем воденом слоју. Ова техника захтева пажљиву контролу концентрације соли и пХ за добре резултате. Траје дуго, а и фенол и хлороформ су врло токсичне хемикалије. Сходно томе, док су екстракције фенол-хлороформа некада биле рутина, друге технике су постале популарније последњих година.

Анион-Екцханге хроматографија

Ањонски измењивачка хроматографија нуди већу чистоћу и доследније резултате од екстракције фенол-хлороформом. Цев или колона су препуне малих честица које имају позитивно наелектрисана места на којима се негативно наелектрисани молекул или анион могу везати. ДНК се везује за ова места размене аниона, док се други загађивачи попут протеина и РНК испирају са колоне. Касније се раствор богат сољу користи за извлачење ДНК из колоне.

Комплети

Најбржа и можда најпоузданија техника за пречишћавање ДНК је употреба посебно произведеног комплета. Ови комплети садрже мембране од силика гела у цеви. ДНК се лепи за мембрану, док се други загађивачи испирају помоћу низа специјално припремљених раствора соли који долазе са комплетом. На крају, ДНК се испере са колоне раствором са мало соли. Ови сетови су брзи, једноставни за употребу и нуде поновљиве резултате.

Апсорпција

Једном када је ДНК изолована и ресуспендована у пуферском раствору контролисаном пХ, последњи корак је тестирање њене чистоће. Једноставан и прикладан начин да то урадите је провером колико ултраљубичастог светла упија на таласним дужинама од 260 и 280 нанометара. Апсорпција на 260 нанометара подељена апсорпцијом на 280 нанометара треба да буде једнака 1,8 ако је ДНК чиста. Мерење апсорбанције на 260 нанометара такође вам омогућава да одредите концентрацију ДНК.

  • Објави
instagram viewer