Генетски нацрт ћелије кодиран је унутар њеног генетског материјала или ДНК. Како ДНК никада не напушта језгро ћелије, како би ове информације доспеле у цитоплазму где и друге протеини и биохемијске компоненте бораве, неопходно је прво транскрибовати ДНК у мессенгер РНА (мРНА или поли (А) РНК). Ова мРНК се затим претвара у протеине који извршавају многе функције ћелије. Да би се откриле или квантификовале врло ретке мРНК, направиле сонде за микромреже или изградиле библиотеке комплементарних молекула ДНК, мРНК мора бити изолована. Међутим, екстракција укупне РНК (тј. Све РНК у ћелији) и накнадна изолација мРНК нису међусобно искључиви процеси; прво се мора извршити да би се мРНК извукла.
ТРИзол хомогенизација: Укупна РНК укључује сву мРНК, трансферну РНК, рибосомску РНК и друге некодирајуће РНК. Да би се ове целине одвојиле од осталих ћелијских компонената, ћелија се прво отвори и ослободи садржај. То се постиже ресуспендирањем ћелија пелетираних центрифугирањем (центрифугирање великим брзинама) у ТРИзол Реагенсу (Лифе Тецхнологиес). Друге верзије ТРИзола (попут Амбионовог ТРИ реагенса) раде слично.
Укупна изолација РНК: Низ центрифугирања користи се за раздвајање различитих компонената (протеина, ДНК, РНК) ћелије у слојеве или фазе унутар суспензије. Горња, жута фаза састоји се од масти и може се одбацити. Жељена фаза је обојена у црвено, садржи укупну РНК и задржава се. Након извођења екстракције фенол-хлороформом и низа алкохолних прања помоћу изопропанола и етанола, РНК се може пелетирати ради изолације мРНК. Додајте инхибиторе РНасе да бисте спречили да овај ензим разгради укупну РНК.
Екстракција мРНК: Уобичајено је користити комплет за изолацију мРНК, јер домаћи лабораторијски протоколи не генеришу велике количине високо пречишћених мРНК. Комерцијални комплети укључују Инвитроген-ову ФастТрацк 2.0 или Амбион-ову поли (А) чисту мРНК изолацију Кит. Ови основни кораци су заједнички за такве комплете:
д) Центрифугирајте овај узорак и извадите супернатант, који се опере неколико пута у низу пуфера за везивање и мало соли који се налазе у комплету.
Референце
- „протоколи библиотеке цДНА?“; Иан Г. Цовелл и Царолине А. Аустин; 1997
- „Ин витро транскрипција и протоколи превођења?“; Мартин Ј. Тиммс; 1995
Савети
- Држите све реагенсе, ћелије и РНК хладним потапајући их у лед. Ово спречава да се РНК разграђују било који други ензими који се ослобађају током процеса хомогенизације.
Упозорења
- Реагенси као што је ТРИзол су токсични и не смеју бити у контакту са кожом или слузокожом. Увек се придржавајте сигурних лабораторијских протокола приликом руковања овим реагенсом.
О аутору
Палмер Овиоунг је магистар међународног пословања на Калифорнијском универзитету у Сан Диегу и Дипломирани уметник социологије са Калифорнијског универзитета у Санта Барбари и обучени је молекулар биолог. Слободни је писац од 2006. године. Поред писања, редовни је Форек трговац и Интернет продавац.
Пхото Цредитс
Јупитеримагес / Пхотос.цом / Гетти Имагес