Како се ДНК визуализује помоћу електрофорезе у гелу?

Електрофореза у гелу је техника која омогућава ДНК да се анализира на нивоу саставних молекула. У овој методи визуелизације ДНК, узорци се постављају на медиј агарозног гела и на њега се наноси електрично поље. То узрокује да фрагменти ДНК мигрирају кроз гел различитим брзинама у складу са њиховим електрохемијским својствима.

Етхидиум Бромиде

За ову технику визуализације, етидијум бромид се помеша са прахом агарозе, ЕДТА пуфером и водом да би се формирао гел матрикс пре електрофорезе. Као резултат, молекули етидијум-бромида постају једнолико распршени по матрици. Једном када се јамице гела напуне одговарајућим узорцима ДНК и бојама за праћење, примењује се напон да се полако вуку велика, поларна једињења преко матрице.

Током овог кретања, базе молекула ДНК привремено се везују за честице захваљујући набоју етидијум-бромида, вукући их за собом. Док је електрофореза у гелу завршена, сваки молекул ДНК је покупио значајну количину етидијум-бромида.

У присуству ултраљубичастог светла, етидијум бромид показује флуоресценцију. Техничари сијају посебно калибрисану УВ светлост преко гела док машина снима слику ужарених фрагмената.

instagram story viewer

Метилен плаво

Ако УВ трансиллуминатор није доступан или је практичан, техничари могу учинити ДНК видљивом у нормалним условима натапањем готовог агарозног гела, са електрофорезом ДНК унутра, у раствору метилен плаве преко ноћи.

Хлоридна со са знатно хидрофобним анионом, молекули метилен плаве боје продиру кроз целу матрицу гела. Међутим, водонична веза кроз ДНК доводи до накупљања молекула мрље. Ова повећана густина мрља на ДНК даје дубљу нијансу плаве боје, видљиву голим оком.

Праћење боја

Изузев релативне величине ДНК трака, техничари могу да мере апсолутну величину (у паровима база) сваког фрагмента помоћу хемикалија које се називају боје за праћење. Видљиве без додавања метилен плаве или етидијум бромида, боје за праћење попут бромофенол плаве и ксилен цијанола крећу се по арагозне гел матрице током електрофорезе истом брзином као фрагменти ДНК који се састоје од 300 нуклеотида и 4.000 нуклеотида, редом. У електрофорези, масивнији фрагменти ДНК путују кроз матрицу гела споријом брзином од мањих фрагмената. Стога, док праћење боја не утиче директно на видљивост фрагмената ДНК, упоређујући положај фрагмента ДНК у гелу до положаја ових боја омогућавају техничарима да "виде" приближни број нуклеотида ДНК фрагмент садржи.

Teachs.ru
  • Објави
instagram viewer