Спектрофотометрија је непроцењив алат у хемији и биологији. Основна идеја је једноставна: различите супстанце апсорбују светлост / електромагнетно зрачење боље на неким таласним дужинама него на другима. Због тога су неки материјали прозирни, док су други на пример обојени. Када кроз раствор осветљавате светлост дате таласне дужине, што је већа његова концентрација, то ће упити више светлости. Да бисте израчунали концентрацију, потребно је да упоредите очитање са очитањима за стандарде познате концентрације. Доле наведени поступак је прилично генерички поступак написан имајући на уму лабораторију за наставу хемије, али се може изменити и за друга подешавања.
Као и увек док радите у лабораторији, обуците заштитне наочаре, рукавице и капут са дугим рукавима како бисте осигурали сопствену сигурност.
Стисните гумену сијалицу да је испразните из ваздуха, а затим је поставите на врх градуиране пипете и пустите да се сијалица опусти тако да усисава воду у пипету. Затим уклоните сијалицу и поклопите врх пипете прстом; ово ће запечатити пипету тако да раствор из ње не потече док вам прст не уклони. Лагано подигните ивицу прста да мало пипете исцури из пипете, све док не постигнете жељену јачину звука. Вежбајте са мало воде и чашом да бисте стекли осећај како делује дипломирана пипета. Веза у одељку Ресурси садржи филмски исечак који вам показује како се користи пипета у случају да никада пре нисте радили са њом.
Означите 5 епрувета као стандарде 1-5. Можете их означити помоћу селотејпа и оловке или маркером за суво брисање.
Изаберите пет концентрација за своје стандарде. Желите да се стандардне концентрације одвоје једна од друге за приближно исти интервал - нпр. 0,1 моларна, 0,2 моларна, 0,3 моларна итд. - и у приближно истом опсегу као што очекујете да ће бити и ваша непозната. За сада користите следећих пет концентрација, али имајте на уму да ћете их морати модификовати приликом извођења сопственог експеримента:
Стандард 1: 0,1 молар Стандард 2: 0,2 молар Стандард 3: 0,3 молар Стандард 4: 0,4 молар Стандард 5: 0,5 молар
Затим узмите 1 моларни стандардни раствор и додајте следеће количине у епрувете 1-5. Запамтите, ове количине се израчунавају помоћу горе наведених концентрација, па ћете их можда морати модификовати по потреби приликом извођења сопственог експеримента.
Стандард 1: 0,8 милилитара Стандард 2: 1,6 милилитара Стандард 3: 2,4 милилитара Стандард 4: 3,2 милилитара Стандард 5: 4 милилитара
Исперите градуирану пипету, а затим пренесите следеће количине дејонизоване воде:
Стандард 1: 7,2 милилитара Стандард 2: 6,4 милилитара Стандард 3: 5,6 милилитара Стандард 4: 4,8 милилитара Стандард 5: 4,0 милилитара
У основи је идеја да количина раствора у свакој епрувети достигне до 8 милилитара.
Покријте сваку од стандардних епрувета парафилмом и преокрените их да се мешају.
Означите још пет епрувета као „Непознато 1-5“. У сваку додајте исте количине вашег непознатог или тест решења, као што сте користили са 1 моларним раствором за стандарде. Другим речима, непознати 1 садржаће 0,8 милилитара испитног раствора и 7,2 милилитара воде, непознати 2 садржаће 1,6 милилитара испитног раствора и 6,4 милилитара воде и тако даље напред.
Покријте сваку непознату парафилмом и пажљиво обрните да се меша.
Укључите спектрофотометар и оставите да се загреје. Дужина потребног времена зависиће од модела и произвођача.
Подесите таласну дужину на спектрофотометру. Таласна дужина ће зависити од врсте хемикалије у вашем експерименту. За сада претпоставите 500 нм, мада имајте на уму да ћете ово морати да промените за различите експерименте.
Калибрирајте свој спектрофотометар. Поступак калибрације ће се разликовати у зависности од уређаја који користите. За Спецтрониц 20, уобичајени модел у наставним лабораторијама, прво ћете прилагодити машину тако да чита „0 посто Т“ када није напуњена ниједна кивета, подесите је тако да гласи „100% Т“ када је празна кивета која садржи само дејонизовану воду натоварен. Ови поступци се могу разликовати у зависности од врсте машине коју користите, па потражите детаље у упутству произвођача.
Након калибрације машине, узмите стандардну 1 епрувету и сипајте садржај у чисту кивету док не дође до линије за пуњење. Обришите кивету крпом да бисте уклонили отиске прстију или другу прљавштину. Уметните кивету у спектрофотометар и забележите очитање „% Т“.
Поновите овај поступак за свих 10 узорака. ОБВЕЗНО очистите кивету између узорака како бисте били сигурни да су ваши резултати што прецизнији.
Узмите резултате за своје стандарде и унесите их у програм за табеле / графике као што су Екцел или ОпенОффице.
Помоћу програма за прорачунске табеле поделите 100 процената са сваком од вредности „% Т“ за стандарде, а затим узмите евиденцију резултата. Овај прорачун ће вам дати апсорбанцију. Ако унесете формулу, ваш прорачунски програм ће извршити прорачун уместо вас.
Пример: Ако је% Т 50,6, формула коју унесете у програм за прорачунске табеле била би следећа:
трупац (100 / 50.6)
Програм прорачунских табела ће извршити рачунање.
Урадите исто за свих пет непознатих / експерименталних вредности.
Графикујте вредности апсорбанције за свих пет стандарда, са концентрацијом на к оси и апсорбанцијом на и оси. Помоћу програма за прорачунске таблице на овај графикон уклопите линеарну једначину. Једначина ће бити у облику и = мк + б. Већина програма прорачунских табела имаће функцију линеарне регресије. У корисничком приручнику за програм прорачунских таблица потражите детаље о томе како се користи функција линеарне регресије.
Узмите једначину за линију која најбоље одговара вашем програму прорачунских табела и решите је за и одузимањем б са обе стране и дељењем обе стране са м. Резултат ће изгледати овако:
(и - б) / м = к
где су б и м вредности које проналази ваш програм за прорачунске табеле.
Проверите вредности апсорбанције за непознате и одаберите три које спадају у исти опсег као и стандарди. Користите ове три вредности апсорбанције за преостале прорачуне. Ако свих пет спада у исти опсег као и стандарди, уместо њих можете да користите свих пет, али треба да користите најмање три.
Укључите сваку од три вредности апсорбанције у своју једначину уместо и. Имајте на уму да је ваша једначина била у следећем облику:
(и - б) / м = к
Дакле, желећете да укључите вредност апсорбанције за сваку непознату у једначину уместо и, а затим израчунајте к. Помоћу програма за прорачунске табеле можете да направите овај прорачун и учините га бржим. Сада сте израчунали концентрацију хемикалије која вас занима у три ваше разблажене непознанице. Првобитни раствор је разблажен да би се припремиле ове непознанице, тако да сада морате радити уназад и израчунати концентрацију оригиналног раствора на основу фактора разблажења.
Сваки непознати узорак који сте убацили у спектрофотометар разблажен је другачијом количином. Сходно томе, концентрацију коју сте израчунали на основу апсорбанције за свако непознато очитавање сада треба да поделите са следећим:
Непознато 1: Делити са 0,1 Непознато 2: Делити са 0,2 Непознато 3: Делити са 0,3 Непознато 4: Делити са 0,4 Непознато 5: Делити са 0,5
Запамтите, међутим, да су ове бројке засноване на претпоставци да користите претходно наведена разблажења. Не заборавите да промените ове вредности ако сте своје узорке разблажили за другу количину.
Додајте своје резултате заједно и поделите их са бројем резултата. Ово ће вам дати просек. Пријавите овај број као свој налаз за концентрацију оригиналног раствора.
Ствари које ће вам требати
- Оловка
- Папир
- Калкулатор
- Рукавице
- Заштитне наочари
- Капут са дугим рукавима
- Спектрофотометар
- Стаклене кивете
- Парафилм
- Кимвипес
- Дејонизована вода
- Решење које желите да тестирате (непознате концентрације)
- 1 моларни стандардни раствор хемикалије присутан у вашем раствору за испитивање
- Дипломирана пипета и сијалица
- Епрувете и носач епрувета
- Беакер
Савети
Овај поступак можда звучи сложено, али заправо је прилично једноставан кад једном започнете. Покушајте да погледате два видео записа у одељку Ресурси да бисте се упознали са процедуром.