Nukleotidi so kemični gradniki življenja in jih najdemo v DNK živih organizmov. Vsak nukleotid je sestavljen iz sladkor, fosfat in a baza, ki vsebuje dušik: adenin (A), timin (T), citozin (C) in gvanin (G). Poseben vrstni red teh nukleotidnih baz določa, katere beljakovine, encime in molekule bo celica sintetizirala.
Določanje vrstnega reda ali zaporedja nukleotidov je pomembno za preučevanje mutacije, evolucija, napredovanje bolezni, genetsko testiranje, forenzične preiskave in medicina.
Genomika in zaporedje DNA
Genomika je preučevanje DNK, genov, interakcij genov in vplivov okolja na gene. Skrivnost razkrivanja zapletenega notranjega delovanja genov je v tem, da lahko prepoznamo njihovo strukturo in lokacijo na kromosomih.
Načrt živih organizmov določa vrstni red (ali zaporedje) baznih parov nukleinske kisline v DNA. Ko se DNA replicira, se adenin pari s timinom, citozin pa z gvaninom; upoštevajo se neusklajeni pari mutacije.
Od dvojne vijačnice deoksiribonukleinska kislina Molekula (DNA) je bila zasnovana leta 1953, dramatične izboljšave so bile narejene na področju genomike in obsežnega zaporedja DNA. Znanstveniki si prizadevno prizadevajo, da bi to novo znanje uporabili za individualizirano zdravljenje bolezni.
Hkrati pa razprave raziskovalcem omogočajo, da ostanejo pred etičnimi posledicami tako hitro eksplodirajočih tehnologij.
Opredelitev zaporedja DNA
Sekvenciranje DNA je postopek odkrivanja zaporedja različnih nukleotidnih baz v delčkih DNA. Sekvenciranje celotnih genov omogoča primerjavo kromosomov in genov, prisotnih v isti in različnih vrstah.
Kartiranje kromosomov je koristno za znanstvene raziskave. Analiza mehanizmov in strukture sistema genialeli in kromosomske mutacije v molekulah DNA na primer predlagajo nove načine zdravljenja genetskih motenj in zaustavitve rakastega tumorja.
Zaporedje DNA: zgodnje raziskave
Metode zaporedja DNA Fredericka Sangerja močno napredovala na področju genomike, začenši v sedemdesetih letih. Sanger se je počutil pripravljenega za reševanje zaporedja DNA po uspešnem zaporedju RNA pri preučevanju insulina. Sanger ni bil prvi znanstvenik, ki se je ukvarjal s sekvenciranjem DNK. Vendar pa so njegove pametne metode zaporedja DNK, razvite skupaj s kolegoma Bergom in Gilbertom, leta 1980 prejele Nobelovo nagrado.
Največja ambicija Sangerja je bilo sekvenciranje obsežnih, celih genomov, vendar sekvenciranje v minuskuli bazni pari bakteriofaga so prebledeli v primerjavi z zaporedjem 3 milijard osnovnih parov človeka genom. Kljub temu je bil nauk, kako zaporediti celoten genom nizkocenovnega bakteriofaga, velik korak k sestavljanju celotnega genoma človeških bitij. Ker DNK in kromosome sestavljajo milijoni baznih parov, večina metod zaporedja ločuje DNA na majhne verige, nato pa segmente DNA sestavljajo skupaj; samo čas ali hitri, dovršeni stroji.
Osnove zaporedja DNA
Sanger je poznal potencialno vrednost njegovega dela in je pogosto sodeloval z drugimi znanstveniki, ki so delili njegova zanimanja za DNK, molekularna biologija in znanosti o življenju.
Čeprav so bile počasne in drage v primerjavi z današnjimi tehnologijami sekvenciranja, so bile takrat Sangerjeve metode sekvenciranja DNA pohvaljene. Po poskusih in napakah je Sanger našel skrivni biokemični "recept" za ločevanje verig DNA, ustvarjanje več DNA in določanje vrst nukleotidov v genomu.
Kakovostne materiale je mogoče zlahka kupiti za uporabo v laboratorijskih študijah:
- DNA polimeraza je encim, potreben za tvorbo DNA.
- DNA primer pove encimu, kje naj začne delati na verigi DNA.
- dNTP so organske molekule, sestavljene iz sladkorja deoksiriboze in nukleozidnih trifosfatov - dATP, dGTP, dCTP in dTTP - ki sestavljajo beljakovine
- Zaključki verige so nukleotidi v barvi, imenovani tudi terminatorski nukleotidi za vsako bazo - A, T, C in G.
Metode zaporedja DNA: Sangerjeve metode
Sanger je ugotovil, kako DNK razrezati na majhne segmente z uporabo encima DNA polimeraze.
Nato je naredil več DNK iz predloge in v novo DNK vstavil radioaktivne slednike, da je razmejil dele ločenih verig. Prav tako je spoznal, da encim potrebuje temeljni premaz, ki se lahko veže na določeno mesto na predlošku. Leta 1981 se je Sanger znova zapisal v zgodovino, ko je ugotovil genom 16.000 baznih parov mitohondrijske DNA.
Drug razburljiv razvoj je bila metoda puške, ki je naključno vzorčila in sekvencirala do 700 osnovnih parov hkrati. Sanger je znan tudi po svoji uporabi metode dideoksi (dideoksinukleotid), ki med sintezo DNA vstavi verižno končni nukleotid, da označi odseke DNK za analizo. Dideoksinukleotidi motijo aktivnost DNA polimeraze in preprečujejo, da bi se nukleotidi nadgradili na verigi DNA.
Koraki zaporedja DNA
Med postopkom zaporedja je treba skrbno prilagajati temperaturo. Najprej se v cev dodajo kemikalije in segrejejo, da se razplete (denaturira) dvoverižno Molekula DNA. Nato se temperatura ohladi, tako da se temeljni premaz poveže.
Nato se temperatura poviša, da se spodbudi optimalna aktivnost DNA polimeraze (encima).
Polimeraza običajno uporablja običajne nukleotide, ki so dodani v višji koncentraciji. Ko pride polimeraza do "z verigo končanega" z barvilom vezanega nukleotida, se polimeraza ustavi in veriga se tam konča, kar pojasnjuje, zakaj se pobarvani nukleotidi imenujejo »zaključna veriga« oz "Terminatorji."
Postopek se nadaljuje mnogokrat. Sčasoma je bil z barvilom povezan nukleotid postavljen na vsak posamezen položaj zaporedja DNA. Gel elektroforeza in računalniški programi lahko nato prepoznajo barve barv na vsaki od verig DNA in ugotovi celotno zaporedje DNA glede na barvilo, položaj barvila in dolžino pramenov.
Napredek v tehnologiji sekvenciranja DNA
Visoko zmogljivo zaporedje - na splošno imenovano zaporedje naslednje generacije - uporablja nove napredke in tehnologije za zaporedje nukleotidnih baz hitreje in ceneje kot kdaj koli prej. Stroj za zaporedje DNA lahko zlahka obdeluje obsežne dele DNK. Pravzaprav je mogoče celotne genomov narediti v nekaj urah, namesto v letih s Sangerjevimi tehnikami zaporedja.
Metode zaporedja naslednje generacije lahko obdelajo obsežne analize DNA brez dodanega koraka pomnoževanja ali kloniranja, da dobijo dovolj DNA za sekvenciranje. Stroji za zaporedje DNA vodijo več reakcij zaporedja hkrati, kar je ceneje in hitreje.
V bistvu nova tehnologija sekvenciranja DNA vodi na stotine Sangerjevih reakcij na majhnem, lahko berljivem mikročipu, ki ga nato zažene skozi računalniški program, ki sestavi zaporedje.
Tehnika bere krajše fragmente DNA, vendar je vseeno hitrejša in učinkovitejša od Sangerjevih metod zaporedja, zato je mogoče tudi obsežne projekte hitro zaključiti.
Projekt človeškega genoma
The Projekt človeškega genoma, dokončana leta 2003, je ena najslavnejših študij zaporedja do zdaj. Glede na članek iz leta 2018 v Znanstvene novice, človeški genom sestavlja približno 46.831 genov, kar je bil močan izziv za zaporedje. Vrhunski znanstveniki z vsega sveta so skoraj 10 let sodelovali in svetovali. Vodi Nacionalna raziskava človeškega genoma
Institute, je projekt uspešno začrtal človeški genom z uporabo sestavljenega vzorca, odvzetega anonimnim krvodajalcem.
Projekt človeškega genoma se je za preslikavo baznih parov oprl na metode zaporedja bakterijskih umetnih kromosomov (na osnovi BAC). Tehnika je uporabila bakterije za kloniranje fragmentov DNA, kar je povzročilo velike količine DNA za sekvenciranje. Klone so nato zmanjšali v velikosti, jih postavili v stroj za zaporedje in jih sestavili v raztežaje, ki predstavljajo človeško DNA.
Drugi primeri sekvenciranja DNA
Nova odkritja v genomiki močno spreminjajo pristope k preprečevanju, odkrivanju in zdravljenju bolezni. Vlada je za raziskave DNK namenila milijarde dolarjev. Organi pregona se za reševanje primerov opirajo na analizo DNK. Komplete za testiranje DNK lahko kupite za domačo uporabo za raziskovanje prednikov in prepoznavanje genskih različic, ki lahko predstavljajo tveganje za zdravje:
- Genomska analiza vključuje primerjavo in kontrastiranje zaporedij genoma številnih različnih vrst na področjih in kraljestvih življenja. Sekvenciranje DNA lahko razkrije genetske vzorce, ki osvetlijo novo svetlobo, ko so bila določena zaporedja uvedena evolucijsko. Prednike in selitve je mogoče izslediti z analizo DNK in jih primerjati s preteklimi zapisi.
- Napredek medicine se dogajajo eksponentno, ker ima skoraj vsaka človeška bolezen genetsko komponento. Zaporedje DNK znanstvenikom in zdravnikom pomaga razumeti, kako več genov medsebojno deluje in okolje. Hitro zaporedje DNK novega mikroba, ki povzroča izbruh bolezni, lahko pomaga prepoznati učinkovita zdravila in cepiva, preden problem postane resen problem javnega zdravja. Različice genov v rakavih celicah in tumorjih je mogoče zaporedoma uporabiti za razvoj individualiziranih genskih terapij.
- Forenzična znanost vloge so bile uporabljene za pomoč organom pregona pri reševanju tisočih težkih primerov od konca osemdesetih let, po poročanju Nacionalni inštitut za pravosodje. Dokazi na kraju zločina lahko vsebujejo vzorce DNK iz kosti, las ali telesnega tkiva, ki jih je mogoče primerjati s profilom DNK osumljenca, da se lažje ugotovi krivda ali nedolžnost. Verižna reakcija s polimerazo (PCR) je pogosto uporabljena metoda za kopiranje DNK iz dokazov pred sledenjem.
- Zaporedje novoodkritih vrst lahko pomaga prepoznati, katere druge vrste so si najbolj povezane in razkrije informacije o evoluciji. Taksonomi uporabljajo "črtne kode" DNA za razvrščanje organizmov. Glede na Univerza v Gruziji maja 2018 naj bi še odkrili 303 vrst sesalcev.
- Genetsko testiranje na bolezni poiščite mutirane genske različice. Večina jih je enonukleotidnih polimorfizmov (SNP), kar pomeni, da se v zaporedju spremeni le en nukleotid iz "običajne" različice. Okoljski dejavniki in življenjski slog vplivajo na to, kako in ali se nekateri geni izražajo. Globalna podjetja dajejo najnovejše tehnologije zaporedja zaporedja nove generacije na voljo raziskovalcem po vsem svetu, ki jih zanimajo multigene interakcije in zaporedje celotnega genoma.
- Genealoški DNK kompleti uporabite zaporedja DNA v njihovi bazi podatkov, da preverite, ali obstajajo različice v genih posameznika. Komplet zahteva vzorec sline ali bris obraza, ki ga pošljejo v komercialni laboratorij za analizo. Poleg podatkov o prednikih lahko nekateri kompleti prepoznajo polimorfizme posameznih nukleotidov (SNP) ali druge dobro znane genetske različice, kot so geni BRCA1 in BRCA2, povezani z večjim tveganjem za ženske dojke in rak jajčnikov.
Etične posledice zaporedja DNA
Nove tehnologije pogosto prihajajo z možnostjo socialne koristi in škode; primeri vključujejo nedelujoče jedrske elektrarne in jedrsko orožje za množično uničevanje. Tudi tehnologije DNK nosijo tveganja.
Čustveni pomisleki glede orodij za zaporedje DNA in urejanje genov, kot je CRISPR, vključujejo strahove, da tehnologija lahko olajša kloniranje ljudi ali privede do mutiranih transgenih živali, ki jih ustvari prevarant znanstvenik.
Etična vprašanja, povezana z zaporedjem DNA, so pogosteje povezana z informiranim soglasjem. Enostaven dostop do neposrednega testiranja DNK za potrošnike pomeni, da potrošniki morda ne bodo popolnoma razumeli, kako se bodo njihove genetske informacije uporabljale, shranjevale in delile. Laiki morda čustveno niso pripravljeni spoznati svojih okvarjenih genskih različic in zdravstvenih tveganj.
Tretje osebe, kot so delodajalci in zavarovalnice, bi lahko diskriminirale posameznike, ki imajo gene z napako, kar lahko povzroči resne zdravstvene težave.