Molekularno kloniranje je pogosta biotehnološka metoda, ki bi jo moral poznati vsak študent in raziskovalec. Molekularno kloniranje z uporabo vrste encima, imenovanega restrikcijski encim, za rezanje človeške DNA na fragmente, ki jih je nato mogoče vstaviti v plazmidno DNA bakterijske celice. Restrikcijski encimi prepolovijo dvoverižno DNA. Odvisno od restrikcijskega encima lahko rez povzroči lepljiv konec ali topi konec. Lepljivi konci so bolj uporabni pri molekularnem kloniranju, ker zagotavljajo, da je fragment človeške DNA v plazmid vstavljen v pravo smer. Postopek ligacije ali spajanje fragmentov DNA zahteva manj DNA, če ima DNA lepljive konce. Nazadnje, več lepljivih encimov za omejevanje lahko tvori isti lepljiv konec, čeprav vsak encim prepozna drugačno zaporedje restrikcij. To povečuje verjetnost, da bodo vaše DNA območje, ki vas zanima, izrezali lepljivi končni encimi.
Omejevalni encimi in mesta za omejevanje
Restrikcijski encimi so encimi, ki režejo prepoznajo specifična zaporedja na dvoverižni DNA in pri tem zaporedju DNK prepolovijo. Prepoznano zaporedje se imenuje restrikcijsko mesto. Restrikcijski encimi se imenujejo endonukleaze, ker na mestih, ki so med konci DNA, režejo dvoverižno DNA, tako DNK običajno obstaja. Obstaja več kot 90 različnih restrikcijskih encimov. Vsak prepozna ločeno mesto omejitev. Restrikcijski encimi cepijo svoja omejevalna mesta 5000-krat bolj učinkovito kot druga mesta, ki jih ne prepoznajo.
Prava usmeritev
Restrikcijski encimi spadajo v dva splošna razreda. DNK razrežejo na lepljive ali tope konce. Lepljiv konec ima kratko območje nukleotidov, gradnikov DNK, ki ni seznanjeno. Ta neparna regija se imenuje previs. Previs naj bi bil lepljiv, ker se želi in se bo združil z drugim lepljivim koncem, ki ima komplementarno zaporedje previsov. Lepljivi konci so kot davno izgubljeni dvojčki, ki se hočejo ob objemu močno objeti. Po drugi strani pa topi konci niso lepljivi, ker so vsi nukleotidi že seznanjeni med obema verigama DNA. Prednost lepljivih koncev je, da se fragment človeške DNK lahko prilega bakterijskemu plazmidu samo v eno smer. Če pa imata človeška DNA in bakterijski plazmid tope konce, lahko človeško DNA v plazmid vstavimo od glave do repa ali od glave do repa.
Za povezovanje lepljivih koncev je treba manj DNA
Čeprav se DNA s konicami palic lažje medsebojno najdejo zaradi svoje "lepljivosti", se niti lepljivi konci niti topi konci ne morejo zliti v neprekinjen kos DNA. Za tvorjenje neprekinjenega kosa DNA, ki je popolnoma povezan, je potreben encim, imenovan ligaza. Ligaze povezujejo hrbtenice nukleotidov na lepljivih ali topih koncih, kar povzroči neprekinjeno verigo nukleotidov. Ker se lepljivi konci hitreje znajdejo zaradi medsebojne privlačnosti, postopek ligiranja zahteva manj človeške DNA in manj plazmidne DNA. Manj verjetno je, da se bodo topi konci DNA in plazmidi medsebojno našli, zato je treba za ligacijo topih koncev v epruveto vstaviti več DNA.
Različni encimi lahko dajo enak lepljiv konec
Omejitvena mesta se nahajajo po celotnem genomu organizmov, vendar niso enakomerno razporejena. V plazmidih jih je mogoče izdelati tako, da se nahajajo tik ob drugem. Znanstveniki, ki želijo iz človeškega genoma izrezati fragment človeške DNK, morajo najti mesta omejevanja, ki so spredaj in zadaj v predelu fragmenta. Poleg zagotavljanja, da je fragment DNA vstavljen v pravo smer, lahko različni lepljivi končni encimi ustvarijo isti lepljivi konec, čeprav prepoznajo različna restrikcijska zaporedja. Na primer, BamHI, BglII in Sau3A imajo različna prepoznavna zaporedja, vendar proizvajajo enak lepljiv konec GATC. To povečuje verjetnost, da bodo obstajala lepljiva končna mesta za omejevanje, ki obkrožajo vaš človeški gen, ki vas zanima.