Elektroforeza z natrijevim dodecil sulfat-poliakrilamidnim gelom (SDS-PAGE) je biokemijska metoda za identifikacijo beljakovin v raztopini. Kot ponazarjajo Mathews in drugi v "Biokemiji", vzorce beljakovin najprej naložimo v "vdolbinice" ali luknje na enem koncu bloka poliakrilamidnega gela. Nato na gel nanesemo električno polje. SDS, dodan naloženim vzorcem, izniči naravni naboj beljakovin. Iz tega razloga molekulska masa beljakovin sama določa hitrost migracije beljakovin, ko se premikajo skozi gel proti pozitivno napolnjenemu polu, ugotavlja Bitesize Bio. Več proteinov v istem vzorcu se bo torej ločilo med seboj in se preselilo v različne položaje.
Usmerite gelsko fotografijo. "Na vrhu" je lokacija vodnjakov, kamor so bili vzorci prvotno dodani. "Spodaj" je mesto, kjer so vzorci migrirali in najpogosteje vsebujejo barvno fronto, ki označuje selitveno fronto vzorcev. Levo ali desno mora vsebovati "marker", ki se uporablja kot predvidljivo vodilo molekulske mase.
Označite vzorce za vsak pas. Po vrhu se bodo vzorci, dodani v vodnjake, navpično preselili po "pasovih". Zato so vse palice, vidne v navpičnem stolpcu, prišle iz enega vzorca, naloženega neposredno nad njim. Če je stolpce težko vizualizirati, z ravnilom in pisalom postavite obrobe na pasove.
Označite molekularne velikosti pasov na označevalnem pasu. Tržno dostopni markerji imajo sliko vzorca pasu, ki ga pričakujemo, skupaj z molekulskimi masami vsakega pasu. Pasovi so temne obzorne "palice", ki so dejansko obarvani proteini, vdelani v gel.
Narišite rahle vodoravne črte, ki segajo od vsakega markerskega pasu do nasprotnega roba gela. Pazite, da bodo te črte vzporedne z vodnjaki in s sprednjo stranjo barvila. Te vrstice označujejo, kje bi bili proteini z molekulsko maso, ki jih označuje vsak od markerskih pasov, na vsakem pasu. Na primer pas na pasu 4, ki leži tik pod črto, podaljšano od 25-kilodaltona markerski pas bi nakazoval, da je pas pasu 4 molekulsko skoraj, vendar ne ravno 25 kilodaltonov utež.
Vsak pas na vsakem pasu označite z ocenjeno molekulsko maso. Oznake uporabite kot vodilo in ocenite vrednosti med velikostmi oznak.
Pod fotografijo z gelom naredite seznam "beljakovin" za vsak pas. Začnite tako, da navedete, kaj je znano o posameznem vzorcu, na primer njegov izvor ali razmere. Nato navedite ocenjeno molekulsko maso vsakega pasu na pasu. Pasovi z enim pasom kažejo, da vzorec vsebuje samo en protein. Pasovi z več pasovi kažejo na prisotnost več proteinov. Pasovi, ki se izvajajo s selitvijo, so manjši, kot jih predlaga najbližja oznaka, in jih verjetno ni mogoče predvideti, razen če oznaka označuje "manj kot".
Na seznamu beljakovin upoštevajte nenavadnosti. "Zamazan" videz lahko pomeni, da je prisotnih preveč beljakovin ali da je viskoznost vzorca vplivala na njegovo migracijo. Če se zdi, da pasovi presegajo roba pasu ali so precej velike v primerjavi z drugimi pasovi, potem je koncentracija te beljakovine verjetno previsoka in bi jo bilo treba v prihodnosti razredčiti elektroforeza. Sivkast odtenek po celotnem pasu, temnejši od barve gela v ozadju, kaže na nerazločljive delce beljakovin.
Določite identiteto beljakovin na vsakem pasu. Čeprav se to izvaja samo z molekulsko maso, bo vir vsakega pasu verjetno nakazal tudi sledi. Upoštevajte, da lahko beljakovine v nekaterih pogojih ohranijo dimer ali trimer na gelu. Zato se lahko en protein na gelu pojavi kot trije različni pasovi. Tudi če beljakovin ni mogoče identificirati, lahko relativna temnost pasov pomeni koncentracije beljakovin v raztopini. Vse radovedne in neznane beljakovine lahko izoliramo neposredno iz originalnega gela in jih pošljemo v identifikacijo.
Stvari, ki jih boste potrebovali
- Fotografija gela SDS-PAGE, obarvana
- Ključ za uporabljeni marker molekularne teže
- Vladar
- Pero