Aký je prvý krok v polymerázovej reťazovej reakcii?

Polymerázová reťazová reakcia alebo PCR je technika, ktorá fotokopíruje jeden fragment DNA na mnoho fragmentov - exponenciálne veľa. Prvým krokom v PCR je zahriatie DNA tak, aby denaturovala alebo sa roztavila na jednotlivé vlákna. Štruktúra DNA je ako lanový rebrík, v ktorom sú priečky laná s magnetickými koncami. Magnety sa spájajú a vytvárajú priečky, ktoré sa nazývajú páry báz, a tak odolávajú rozťahovaniu. Každý fragment DNA sa pri rôznych teplotách topí v jednotlivé vlákna. Pochopenie toho, ako štruktúru DNA držia pohromade jednotlivé časti DNA, poskytne prehľad o tom, prečo rôzne fragmenty DNA sa topia pri rôznych teplotách a prečo sú v prvom prípade potrebné také vysoké teploty miesto.

Prvým krokom PCR je rozpustenie DNA tak, aby sa dvojvláknová DNA rozdelila na jednovláknovú DNA. Pokiaľ ide o DNA cicavcov, tento prvý krok zvyčajne zahrnuje teplo približne 95 stupňov Celzia (asi 200 stupňov Fahrenheita). Pri tejto teplote sa vodíkové väzby medzi pármi báz A-T a G-C alebo rebríkmi v rebríčku DNA rozpadajú a dvojreťazcovú DNA rozopnú. Teplota však nie je dosť vysoká na to, aby zlomila hlavný reťazec fosfátu a cukru, ktorý tvorí jednotlivé vlákna, alebo póly rebríka. Úplná separácia jednovláknových vlákien ich pripravuje na druhý krok PCR, ktorá je ochladzovaná, aby umožnila krátkym fragmentom DNA, nazývaným priméry, viazať jednovláknové vlákno.

Jedným z dôvodov, prečo sa DNA zahrieva na vysokú teplotu 95 stupňov Celcius, je to, že čím je dvojreťazec DNA dlhší, tým viac chce zostať pohromade. Dĺžka DNA je jedným z faktorov, ktorý ovplyvňuje teplotu topenia zvolenú pre PCR na danom kúsku DNA. Páry báz A-T a G-C vo dvojvláknovej DNA sa navzájom spájajú, aby držali dvojvláknovú štruktúru pohromade. Čím viac po sebe nasledujúcich párov báz medzi dvoma jednovláknovými vláknami sa spojilo, tým viac sa chcú spojiť aj ich susedia, a tým silnejšia je príťažlivosť medzi týmito dvoma vláknami. Je to ako zips vyrobený z malých magnetov. Keď zapnete zips, magnety sa budú prirodzene chcieť zapnúť na zips a zostať na zips.

Ďalším faktorom, ktorý ovplyvňuje teplotu topenia, ktorá sa má pre váš fragment DNA zvoliť, je množstvo párov báz G-C prítomných v danom fragmente. Každý pár báz je ako dva mini magnety, ktoré priťahujú. Pár vyrobený z G a C je priťahovaný oveľa silnejšie ako pár A a T. Teda kúsok DNA, ktorý má viac párov G-C ako iný fragment, bude vyžadovať vyššiu teplotu, aby sa roztavil na jednotlivé vlákna. DNA prirodzene absorbuje ultrafialové svetlo - presnejšie na vlnovej dĺžke 260 nanometrov - a jednoreťazcová DNA absorbuje viac svetla ako dvojreťazcová DNA. Takže meranie množstva absorbovaného svetla je spôsob merania toho, koľko sa vaša dvojvláknová DNA rozpustila v jednotlivé vlákna. Účinok „magnetického zipsu“ párov báz G-C a A-T spôsobuje graf absorpcie svetla dvojvláknová DNA vynesená proti zvýšeniu teploty tak, aby bola sigmoidná, v tvare S, a nie a priamka. Krivka S predstavuje odpor tímovej práce, ktorý vyvíjajú páry báz proti teplu, pretože sa nechcú oddeliť.

Teplota, pri ktorej sa dĺžka DNA topí v jednotlivé vlákna, sa nazýva teplota topenia, ktorá sa označuje skratkou „Tm“. To naznačuje teplotu, pri ktorej sa polovica DNA v roztoku roztavila na jednovláknové a druhá polovica je stále dvojvláknová formulár. Teplota topenia je pre každý fragment DNA iná. Cicavčia DNA má obsah G-C 40%, čo znamená, že zvyšných 60% párov báz je As a Ts. Jeho 40% obsah G-C spôsobuje, že sa cicavčia DNA topí pri teplote 87 stupňov Celzia (asi 189 stupňov Fahrenheita). To je dôvod, prečo je prvým krokom PCR na DNA cicavcov zahriať ju na 94 stupňov Celzia (201 Fahrenheita). Iba o sedem stupňov viac ako je teplota topenia a všetky dvojvlákna sa úplne rozpustia v jednovláknové.