Klonovanie DNA: definícia, postup, príklady

Je možné klonovať celé organizmy, ako napríklad ovca Dolly, ale klonovanie DNA je odlišné. Pri výrobe sa používajú techniky molekulárnej biológie identické kópie sekvencií DNA alebo jednotlivé gény.

Použitím metód genetického inžinierstva sa identifikujú a izolujú segmenty genetického kódu DNA. Klonovanie DNA potom kopíruje DNA nukleová kyselina sekvencie v segmentoch.

Výsledné identické kópie sa môžu použiť na ďalší výskum alebo na biotechnologické aplikácie. Gén, ktorý sa kopíruje, často kóduje proteín, ktorý môže byť súčasťou lekárskej liečby. Technológia DNA vrátane Klonovanie DNA podporuje pochopenie toho, ako fungujú gény a ako genetický kód človeka ovplyvňuje fungovanie tela.

Klonovanie DNA je proces molekulárnej biológie vytvárania identických kópií segmentov DNA nachádzajúcich sa v chromozómoch, ktoré obsahujú genetický kód pokročilých organizmov.

Tento proces generuje veľké množstvá cieľové sekvencie DNA. Cieľom klonovania DNA je produkovať samotné cieľové sekvencie DNA alebo produkovať proteíny kódované v cieľových sekvenciách.

Dve metódy používané pri klonovaní DNA sa nazývajú plazmidový vektor a polymerázová reťazová reakcia (PCR). V plazmidový vektor spôsobom sa reťazce DNA odrežú pomocou reštrikčné enzýmy aby sa vytvorili fragmenty DNA, a výsledné segmenty sa vložia do klonovacích vektorov nazývaných plazmidy na ďalšiu duplikáciu. Plazmidy sú umiestnené v bakteriálnych bunkách, ktoré potom produkujú kópie DNA alebo kódované proteíny.

V Metóda PCRje segment reťazcov DNA, ktorý sa má duplikovať, označený enzýmami tzv primery. Polymerázový enzým vytvára kópie označenej časti reťazca DNA. Táto metóda nepoužíva reštrikčné enzýmy a z malých vzoriek môže produkovať klonovanú DNA. Niekedy sa tieto dve technológie DNA používajú spolu, aby sa do celkovej reakcie zapracovali tie najlepšie vlastnosti.

Vektor spôsobu sa týka plazmidu použitého na udržanie cieľového segmentu DNA, ktorý sa má klonovať. Plazmidy sú malé kruhové pramene nechromozomálna DNA nachádzajú sa v mnohých organizmoch vrátane baktérií a vírusov.

Bakteriálne plazmidy sú vektorom použitým na inzerciu cieľového segmentu DNA do bakteriálnych buniek na ďalšiu duplikáciu.

Výber a izolácia cieľovej DNA: Predtým, ako môže začať proces klonovania DNA, je potrebné identifikovať sekvencie DNA, najmä začiatky a konce segmentov DNA.

Takéto sekvencie DNA možno nájsť pomocou existujúcej klonovanej DNA so známymi sekvenciami alebo štúdiom proteínu produkovaného cieľovou sekvenciou DNA. Len čo je sekvencia známa, môžu sa použiť zodpovedajúce reštrikčné enzýmy.

Rezanie cieľovej DNA reštrikčnými enzýmami: Reštrikčné enzýmy sa vyberú tak, aby sa vyhľadal kód DNA na začiatku a na konci cieľových sekvencií.

Keď reštrikčné enzýmy nájdu špeciálnu kódovanú sekvenciu párov báz nazývanú reštrikčné miesta, urobia to sa na tomto mieste pripútajú k DNA a navinú sa okolo molekuly DNA, čím prerušia vlákno. Odrezané segmenty DNA obsahujúce cieľovú sekvenciu sú teraz k dispozícii na duplikáciu.

Výber plazmidového vektora a vloženie cieľovej DNA: Vhodný plazmid ideálne obsahuje rovnaké sekvencie kódujúce DNA ako reťazec DNA, z ktorého bola cieľová DNA vyrezaná. Kruhové vlákno DNA plazmidu sa štiepi rovnakými reštrikčnými enzýmami, aké sa použili na štiepenie cieľovej DNA.

A Enzým DNA ligáza sa používa na podporu spojenia segmentov DNA a konce cieľového segmentu DNA sa spájajú s odrezanými koncami plazmidovej DNA. Cieľová DNA teraz tvorí súčasť reťazca kruhovej plazmidovej DNA.

Vloženie plazmidu do bakteriálnej bunky: Akonáhle plazmid obsahuje sekvenciu DNA, ktorá sa má klonovať, skutočné klonovanie sa môže uskutočniť pomocou procesu nazývaného bakteriálna transformácia. Plazmidy sú vložené do bakteriálnej bunky, ako je E. coli a bunky s novými segmentmi DNA začnú produkovať kópie a zodpovedajúce proteíny.

Pri bakteriálnej transformácii sa hostiteľské bunky a plazmidy inkubujú spolu pri teplote tela asi 12 hodín. Bunky absorbujú časť plazmidov a zaobchádzajú s nimi ako so svojou vlastnou plazmidovou DNA.

Zber klonovanej DNA a bielkovín: Väčšina plazmidov používaných na klonovanie DNA existuje gény rezistencie na antibiotiká začlenené do ich DNA. Keď bakteriálne bunky absorbujú nové plazmidy, stanú sa rezistentnými voči antibiotikám.

Keď sa kultúra ošetrí antibiotikami, prežijú iba tie bunky, ktoré absorbovali nové plazmidy. Výsledkom je čistá kultúra bakteriálnych buniek s klonovanou DNA. Táto DNA sa potom môže zhromaždiť alebo sa môže pripraviť zodpovedajúci proteín.

The PCR metóda je jednoduchšia a kopíruje existujúcu DNA na danom mieste. Nevyžaduje rezanie reštrikčnými enzýmami alebo vkladanie plazmidDNA sekvencie. Vďaka tomu je obzvlášť vhodný na klonovanie vzoriek DNA s obmedzeným počtom reťazcov DNA. Metóda síce môže klonovať DNA, ale nemožno ju použiť na produkciu zodpovedajúceho proteínu.

Odvíjanie reťazcov DNA: DNA v chromozómoch je pevne stočená do štruktúry dvojitej špirály. Zahrievanie DNA na 96 stupňov Celzia v procese tzv denaturácia molekula DNA sa odvinie a rozdelí na dva reťazce. Táto separácia je potrebná, pretože klonovať možno naraz iba jeden reťazec DNA.

Výber primérov: Rovnako ako pri klonovaní DNA z plazmidového vektora, je potrebné identifikovať sekvencie DNA, ktoré sa majú klonovať, so zvláštnym dôrazom na začiatky a konce segmentov DNA. Priméry sú enzýmy, ktoré sa pripájajú k špecifickým sekvenciám kódu DNA a je potrebné ich zvoliť na označenie cieľových segmentov DNA. Správne priméry sa pripoja k sekvenciám molekuly DNA, aby označili začiatky a konce cieľových segmentov.

Žíhanie reakcie na väzbu primerov: Reakcia sa ochladí na asi 55 stupňov Celzia žíhanie. Keď sa reakcia ochladí, priméry sa aktivujú a pripoja sa k reťazcu DNA na každom konci cieľového segmentu DNA. Priméry pôsobia iba ako markery a reťazec DNA sa nemusí rezať.

Produkcia identických kópií cieľového segmentu DNA: V procese tzv predĺženiesa k reakcii pridá tepelne citlivý enzým TAQ polymeráza. Reakcia sa potom zahreje na 72 stupňov Celzia, čím sa aktivuje enzým. Aktívny enzým DNA polymeráza sa viaže na priméry a kopíruje sekvenciu DNA medzi nimi. Počiatočný proces sekvenovania a klonovania DNA je dokončený.

Zvyšovanie výťažku klonovanej DNA: Počiatočný proces žíhania a extenzie vytvára relatívne málo kópií dostupných segmentov reťazca DNA. Aby sa zvýšil výťažok ďalšou replikáciou DNA, reakcia sa znovu ochladí, aby sa znovu aktivovali priméry a nechali sa naviazať na ďalšie reťazce DNA.

Potom opätovným zahriatím reakcie sa znovu aktivuje polymerázový enzým a vytvorí sa viac kópií. Tento cyklus sa môže opakovať 25 až 30-krát.

Metóda plazmidového vektora sa spolieha na dostatok počiatočného prísunu DNA na rezanie a vloženie do plazmidov. Príliš málo pôvodnej DNA vedie k menšiemu počtu plazmidov a pomalému začiatku produkcie klonovaných DNA.

Metóda PCR môže produkovať veľké množstvo DNA z niekoľkých pôvodných reťazcov DNA, ale pretože DNA nie je implantovaná do bakteriálnej bunky, produkcia proteínu nie je možná.

Na výrobu proteínu kódovaného vo fragmentoch DNA, ktoré sa majú klonovať, z malej počiatočnej vzorky DNA, je možné použiť tieto dva spôsoby spoločne a sa navzájom dopĺňajú. Najprv sa použije metóda PCR na klonovanie DNA z malej vzorky a na vytvorenie mnohých kópií.

Potom sa produkty PCR použijú metódou plazmidového vektora na implantáciu vyrobenej DNA do bakteriálnych buniek, ktoré budú produkovať požadovaný proteín.

Molekulárna biológia využíva klonovanie génov a replikáciu DNA na lekárske a komerčné účely. Baktérie s klonovanými sekvenciami DNA sa používajú na výrobu liekov a nahradenie látok, ktoré si ľudia s genetickými poruchami sami vyrobiť nemôžu.

Typické použitia zahŕňajú:

• Gén pre ľudský inzulín je klonovaný v baktériách, ktoré potom produkujú inzulín používaný diabetikmi.
• Aktivátor tkanivového plazminogénu sa vyrába z klonovanej DNA a používa sa na pomoc zabrániť vzniku krvných zrazenín.
• Ľudský rastový hormón sa dajú vyrobiť a podať ľuďom, ktorí si ho sami vyrobiť nemôžu.

Biotechnológia tiež využíva klonovanie génov v poľnohospodárstve na vytvorenie nových charakteristík rastlín a živočíchov alebo na zlepšenie existujúcich charakteristík. Pretože je klonovaných viac génov, počet možných použití exponenciálne rastie.

Molekuly DNA tvoria malú časť materiálu v živej bunke a je ťažké izolovať vplyvy mnohých génov. Metódy klonovania DNA dodávajú na štúdium veľké množstvo špecifickej sekvencie DNA a DNA produkuje proteíny rovnako ako v pôvodnej bunke. Klonovanie DNA umožňuje izolovane študovať túto operáciu pre rôzne gény.

Medzi typické aplikácie v oblasti výskumu a technológie DNA patrí skúmanie:

• Funkcia génu.
• Mutácie génu.
• Génová expresia.
• Génové výrobky.
• Genetické chyby.

Keď je klonovaných viac sekvencií DNA, je ľahšie nájsť a klonovať ďalšie sekvencie. Existujúce klonované segmenty DNA sa dajú použiť na určenie, či sa nový segment zhoduje so starým a ktoré časti sa líšia. Identifikácia cieľovej sekvencie DNA je potom rýchlejšia a presnejšia.

V génová terapiasa klonovaný gén prezentuje bunkám organizmu, ktorého prirodzený gén je poškodený. Životne dôležitý gén, ktorý produkuje proteín potrebný pre špecifickú funkciu organizmu, môže byť mutovaný, zmenený žiarením alebo ovplyvnený vírusmi.

Ak gén nefunguje správne, v bunke chýba dôležitá látka. Génová terapia sa snaží nahraďte gén klonovanou verziou, ktorá vytvorí požadovanú látku.

Génová terapia je stále experimentálna a pomocou tejto techniky sa vyliečilo len málo pacientov. Problémy spočívajú v identifikácii jediného génu zodpovedného za zdravotný stav a dodaní mnohých kópií génu do správnych buniek. Pretože sa klonovanie DNA stalo čoraz rozšírenejším, génová terapia sa aplikovala v niekoľkých špecifických situáciách.

Medzi posledné úspešné aplikácie patria:

• Parkinsonova choroba: Použitím vírusu ako vektora bol do stredných mozgových ciev pacientov injikovaný gén súvisiaci s Parkinsonovou chorobou. Pacienti zaznamenali zlepšenie motorických schopností bez akýchkoľvek nepriaznivých vedľajších účinkov.
• Nedostatok adenozíndeaminázy (ADA): Genetická imunitná porucha sa liečila odstránením krvných kmeňových buniek pacientov a vložením génu ADA. Výsledkom bolo, že pacienti boli schopní vyrobiť aspoň časť svojich vlastných ADA.
• Hemofília: Ľudia s hemofíliou neprodukujú špecifické proteíny, ktoré pomáhajú zrážaniu krvi. Gén na produkciu jedného z chýbajúcich proteínov bol vložený do pečeňových buniek pacientov. Pacienti tvorili bielkoviny a znížilo sa riziko krvácania.

Génová terapia je jednou z najsľubnejších aplikácií klonovania DNA, ale je pravdepodobné, že sa rozšíria ďalšie nové použitia, pretože sa študuje viac sekvencií DNA a určuje sa ich funkcia. Klonovanie DNA dodáva surovinu pre genetické inžinierstvo v potrebnom množstve.

Ak je známa rola génov a ich správna funkcia sa dá zabezpečiť nahradením chybných gény, mnoho chronických chorôb a dokonca aj rakovina môžu byť napadnuté a liečené na genetickej úrovni pomocou DNA technológie.

Súvisiaci obsah:

• Charakteristika kolónie E.Coli (Escherichia Coli)
• RNA: definícia, funkcia, štruktúra