Výhody a nevýhody Western Blot

Western blot, analytická technika používaná na určenie konkrétneho proteínu v danej vzorke, využíva schopnosť enzýmu alebo fluorescenčne označenej primárnej protilátky viazať sa na svoj špecifický antigén. Jedná sa o trojkrokový proces, ktorý začína gélovou elektroforézou, nasleduje blotovanie membrány a sondovanie protilátkami. Detekcia proteínov môže byť priama alebo nepriama, pričom druhá detekcia využíva značenú sekundárnu protilátku namierenú proti primárnej. Aj keď je Western blot akceptovaný ako rutinná technika analýzy proteínov, má svoje obmedzenia aj výhody.

Jedným z najväčších argumentov v prospech western blot je jeho citlivosť. Pre svoju schopnosť detegovať vo vzorke len 0,1 nanogramu proteínu môže technika teoreticky slúžiť ako efektívny nástroj včasnej diagnostiky, ktorý sníma aj najmenšiu imunogénnu reakciu vírusu alebo baktérie u pacienta vzorka. Nepriamy westernový prenos ďalej stavia na tejto citlivosti zo schopnosti sekundárnej protilátky zosilňovať intenzitu signálu detegovaného zobrazovacím systémom. Väčšia citlivosť znamená, že na testovanie je potrebných menej protilátok, čo výrazne znižuje laboratórne náklady.

Technika western blot vďačí za svoju špecifickosť dvom veľkým faktorom, ktoré prispievajú. Najskôr gélová elektroforéza roztriedi vzorku na proteíny rôznej veľkosti, náboja a konformácie. Tento proces je sám o sebe obrovským krokom k detekcii, pretože pásy vytvorené v géle už poskytujú informácie o veľkosti požadovaného proteínu alebo polypeptidu. Špecifickosť interakcie protilátka-antigén slúži ako druhý veľký faktor. Pretože špecifické protilátky vykazujú afinitu k špecifickým proteínom, proces môže selektívne detegovať cieľový proteín aj v zmesi 300 000 rôznych proteínov.

Napriek svojej citlivosti a špecifickosti môže western blot stále prinášať chybné výsledky. Falošne pozitívne výsledky, keď protilátka reaguje s nezamýšľaným proteínom, čo je často sa stane, keď má pacient, ktorý je testovaný na HIV, tuberkulózu alebo určitý počet parazitov infekcie. Na druhej strane môže dôjsť k falošne negatívnemu výsledku, ak sa väčším proteínom neposkytne dostatočný čas na správny prenos na membránu. Nesprávne použitie blottingu a spracovania často vedie k skresleniu, vyblednutiu alebo dokonca vzniku viacerých pruhov, čo výsledky testu podmieňuje interpretáciou technika.

Cena Western blotu je zložená z veľkých individuálnych výdavkov na označené protilátky, kvalifikovaných analytikov a laboratórneho vybavenia. Delikátny proces, western blot vyžaduje presnosť v každom kroku, aby bolo možné správne identifikovať zložky vzorky. Drobná chyba v koncentrácii činidla alebo v inkubačnej dobe môže byť pre celý proces katastrofálna. Nakoniec, vybavenie potrebné na detekciu a zobrazovanie - chemiluminiscenčné, fluorescenčné, rádioaktívne alebo laserové detekčné systémy - môže byť pre priemernú mikrobiologickú jednotku príliš drahé.