Sekvenovanie DNA: definícia, metódy, príklady

Nukleotidy sú chemickými stavebnými kameňmi života a nachádzajú sa v DNA živých organizmov. Každý nukleotid pozostáva z cukor, fosfát a a báza obsahujúca dusík: adenín (A), tymín (T), cytozín (C) a guanín (G). Špecifické poradie týchto nukleotidových báz určuje, ktoré proteíny, enzýmy a molekuly budú bunkou syntetizované.

Určenie poradia alebo sekvencie nukleotidov je dôležité pre štúdium mutácie, vývoj, progresia ochorenia, genetické testovanie, súdne vyšetrovanie a medicína.

Genomika je štúdium DNA, génov, interakcií génov a environmentálnych vplyvov na gény. Tajomstvom odhalenia zložitého vnútorného fungovania génov je schopnosť identifikovať ich štruktúru a umiestnenie na chromozómoch.

Návrh živých organizmov je určený poradím (alebo sekvenciou) párov báz nukleových kyselín v DNA. Keď sa DNA replikuje, adenín sa spája s tymínom a cytozín s guanínom; uvažujú sa nezhodné páry mutácie.

Od dvojitej špirály deoxyribonukleová kyselina (DNA) molekula bola konceptualizovaná v roku 1953, došlo k dramatickým zlepšeniam v oblasti genomiky a rozsiahleho sekvenovania DNA. Vedci sa usilovne snažia aplikovať tieto nové poznatky na individualizovanú liečbu chorôb.

Súčasné diskusie zároveň umožňujú vedcom zostať v popredí etických dôsledkov takýchto rýchlo explodujúcich technológií.

Sekvenovanie DNA je proces zisťovania sekvencie rôznych nukleotidových báz v úryvkoch DNA. Sekvenovanie celého génu umožňuje porovnanie chromozómov a genómov prítomných u rovnakých a rôznych druhov.

Mapovanie chromozómov je užitočné pre vedecký výskum. Analýza mechanizmov a štruktúry gény, alely a chromozomálne mutácie v molekulách DNA navrhujú napríklad nové spôsoby liečenia genetických porúch a zastavenia rastu rakovinových nádorov.

Metódy sekvenovania DNA od Fredericka Sangera počnúc 70. rokmi výrazne pokročila v oblasti genomiky. Sanger sa po štúdii inzulínu cítil pripravený zvládnuť sekvenovanie DNA po úspešnom sekvenovaní RNA. Sanger nebol prvým vedcom, ktorý sa pustil do sekvenovania DNA. Jeho chytré metódy sekvenovania DNA - vyvinuté v tandeme s kolegami Bergom a Gilbertom - však v roku 1980 získali Nobelovu cenu.

Sanger poznal potenciálnu hodnotu svojej práce a často spolupracoval s ďalšími vedcami, ktorí zdieľali jeho záujmy v DNA, molekulárna biológia a vedy o živote.

Aj keď boli v porovnaní s dnešnými sekvenovacími technológiami pomalé a drahé, Sangerove metódy sekvenovania DNA boli v tom čase chválené. Po pokusoch a omyloch Sanger našiel tajný biochemický „recept“ na oddeľovanie vlákien DNA, vytváranie väčšieho množstva DNA a identifikáciu poradia nukleotidov v genóme.

Vysoko kvalitné materiály je možné ľahko kúpiť na použitie v laboratórnych štúdiách:

• DNA polymeráza je enzým potrebný na výrobu DNA.
• DNA primer povie enzýmu, kde má začať pracovať na reťazci DNA.
• dNTP sú organické molekuly vyrobené z deoxyribózového cukru a nukleozid trifosfátov - dATP, dGTP, dCTP a dTTP - ktoré zhromažďujú bielkoviny
• Koncovky reťazí sú farbivo zafarbené nukleotidy, ktoré sa tiež nazývajú terminátorové nukleotidy pre každú bázu - A, T, C a G.

Sanger prišiel na to, ako pomocou enzýmu DNA polymerázy rozrezať DNA na malé segmenty.

Potom zo šablóny vytvoril viac DNA a do novej DNA vložil rádioaktívne značkovače, aby vymedzil časti oddelených vlákien. Tiež uznal, že enzým potrebuje primér, ktorý by sa mohol viazať na konkrétne miesto na šablóne vlákna. V roku 1981 sa Sanger opäť zapísal do histórie zisťovaním genómu 16 000 párov báz mitochondriálnej DNA.

Počas procesu sekvenovania musí byť teplota starostlivo nastavená. Najskôr sa do skúmavky pridajú chemikálie a zahrejú sa na rozpletenie (denaturáciu) dvojvlákna Molekula DNA. Potom sa teplota ochladí, aby sa základný náter mohol spojiť.

Ďalej sa teplota zvýši, aby sa podporila optimálna aktivita DNA polymerázy (enzýmu).

Polymeráza typicky používa bežné dostupné nukleotidy, ktoré sa pridávajú vo vyššej koncentrácii. Keď sa polymeráza dostane na „reťazec ukončujúci“ nukleotid spojený s farbivom, polymeráza sa zastaví a končí tu reťazec, čo vysvetľuje, prečo sa zafarbené nukleotidy nazývajú „zakončujúce reťazec“ alebo „Terminátory.“

Proces pokračuje mnohokrát. Nakoniec bol nukleotid spojený s farbivom umiestnený na každú jednu pozíciu sekvencie DNA. Gélová elektroforéza a počítačové programy potom môžu identifikovať farby farbiva na každom z reťazcov DNA a vypočítajte celú sekvenciu DNA na základe farbiva, jeho polohy a dĺžky pramene.

Vysoko výkonné sekvenovanie - všeobecne označovaný ako sekvenovanie novej generácie - využíva nové pokroky a technológie na rýchlejšiu a lacnejšiu sekvenciu nukleotidových báz ako kedykoľvek predtým. Stroj na sekvenovanie DNA ľahko zvládne veľké úseky DNA. Celé genómy je možné vykonať pomocou Sangerových sekvenčných techník v priebehu niekoľkých hodín, namiesto rokov.

Metódy sekvenovania novej generácie dokážu zvládnuť analýzu veľkého objemu DNA bez dodatočného kroku amplifikácie alebo klonovania, aby sa získalo dostatok DNA na sekvenovanie. Stroje na sekvenovanie DNA prevádzkujú viac reakcií sekvenovania naraz, čo je lacnejšie a rýchlejšie.

Nová technológia sekvenovania DNA v podstate spúšťa stovky Sangerových reakcií na malom, ľahko čitateľnom mikročipe, ktorý sa potom spúšťa cez počítačový program, ktorý sekvenciu zostavuje.

Táto technika číta kratšie fragmenty DNA, ale je stále rýchlejšia a efektívnejšia ako Sangerove sekvenčné metódy, takže je možné rýchlo dokončiť aj rozsiahle projekty.

The Projekt ľudského genómu, ukončená v roku 2003, je jednou z najslávnejších štúdií sekvenovania, ktorá sa doteraz uskutočnila. Podľa článku z roku 2018 v Vedecké správy, ľudský genóm pozostáva z približne 46 831 génov, čo bola hrozivá výzva pre postupnosť. Špičkoví vedci z celého sveta strávili takmer 10 rokov spoluprácou a konzultáciami. Vedené Národným výskumom ľudského genómu

Institute, projekt úspešne zmapoval ľudský genóm pomocou zloženej vzorky odobratej od anonymných darcov krvi.

Projekt humánneho genómu sa pri mapovaní bázových párov spoliehal na sekvenčné metódy bakteriálneho umelého chromozómu (založené na BAC). Táto technika používala baktérie na klonovanie fragmentov DNA, čo viedlo k veľkému množstvu DNA na sekvenovanie. Veľkosť klonov bola potom zmenšená, umiestnené do sekvenačného prístroja a zhromaždené do úsekov predstavujúcich ľudskú DNA.

Nové objavy v genomike zásadne menia prístupy k prevencii, detekcii a liečbe chorôb. Vláda vyčlenila na výskum DNA miliardy dolárov. Pri riešení prípadov sa orgány činné v trestnom konaní spoliehajú na analýzu DNA. Sady na testovanie DNA si môžete kúpiť na domáce použitie na výskum predkov a identifikáciu variantov génov, ktoré môžu predstavovať zdravotné riziká:

• Genomická analýza znamená porovnanie a porovnanie sekvencií genómu mnohých rôznych druhov v doménach a kráľovstvách života. Sekvenovanie DNA môže odhaliť genetické vzorce, ktoré vrhajú nové svetlo na to, keď boli určité sekvencie zavedené evolučne. Predkovia a migráciu možno vysledovať pomocou analýzy DNA a porovnať s historickými záznamami.

• Pokrok v medicíne sa dejú exponenciálnou rýchlosťou, pretože prakticky každá ľudská choroba má genetickú zložku. Sekvenovanie DNA pomáha vedcom a lekárom pochopiť, ako viaceré gény interagujú navzájom a s prostredím. Rýchle sekvenovanie DNA nového mikróbu spôsobujúceho prepuknutie choroby môže pomôcť identifikovať účinné lieky a vakcíny skôr, ako sa z problému stane vážny problém v oblasti verejného zdravia. Génové varianty v rakovinových bunkách a nádoroch sa mohli sekvenovať a použiť na vývoj individualizovaných génových terapií.

• Kriminalistická veda Aplikácie sa používajú na to, aby pomohli orgánom činným v trestnom konaní prekonať tisíce zložitých prípadov od konca 80. rokov, tvrdí Národný inštitút spravodlivosti. Dôkazy z miesta činu môžu obsahovať vzorky DNA z kostí, vlasov alebo telesného tkaniva, ktoré je možné porovnať s profilom DNA podozrivého, aby sa zistila vina alebo nevina. Polymerázová reťazová reakcia (PCR) je bežne používanou metódou na vytváranie kópií DNA zo stopových dôkazov pred sekvenovaním.

• Sekvenovanie novoobjavených druhov môže pomôcť zistiť, ktoré ďalšie druhy majú najbližšie príbuzné vzťahy, a odhaliť informácie o vývoji. Taxonómovia používajú na klasifikáciu organizmov „čiarové kódy“ DNA. Podľa Gruzínska univerzita v máji 2018 sa ešte odhaduje 303 druhov cicavcov.

• Genetické testovanie na choroby hľadať mutované varianty génov. Väčšinou ide o polymorfizmy s jedným nukleotidom (SNP), čo znamená, že z „normálnej“ verzie je zmenený iba jeden nukleotid v sekvencii. Faktory životného prostredia a životný štýl ovplyvňujú, ako a či sú vyjadrené určité gény. Globálne spoločnosti sprístupňujú špičkové technológie sekvenovania novej generácie výskumníkom z celého sveta, ktorí sa zaujímajú o multigénové interakcie a sekvenovanie celého genómu.

• Genealogické súpravy DNA používajú sekvencie DNA vo svojej databáze na kontrolu variantov v génoch jednotlivca. Súprava vyžaduje vzorku slín alebo lícny tampón, ktorý sa pošle do komerčného laboratória na analýzu. Okrem informácií o predkoch môžu niektoré súpravy identifikovať jednonukleotidové polymorfizmy (SNP) alebo iné dobre známe genetické varianty, ako sú gény BRCA1 a BRCA2, spojené so zvýšeným rizikom pre ženský prsník a Rakovina vaječníkov.

Nové technológie často prichádzajú s možnosťou spoločenských výhod aj škôd; Príklady zahŕňajú nefunkčné jadrové elektrárne a jadrové zbrane hromadného ničenia. Aj technológie DNA prichádzajú s rizikami.

Emocionálne obavy týkajúce sa nástrojov na sekvenovanie DNA a nástrojov na úpravu génov, ako je CRISPR, zahŕňajú obavy, že táto technológia môže uľahčiť klonovanie ľudí alebo viesť k mutantným transgénnym zvieratám vytvoreným darebákom vedec.

Etické problémy spojené so sekvenovaním DNA sa častejšie spájajú s informovaným súhlasom. Ľahký prístup k testovaniu DNA priamo na zákazníka znamená, že spotrebitelia nemusia úplne pochopiť, ako budú ich genetické informácie použité, uložené a zdieľané. Laici nemusia byť emočne pripravení dozvedieť sa o svojich chybných variantoch génov a zdravotných rizikách.

Tretie strany, ako sú zamestnávatelia a poisťovacie spoločnosti, by mohli potenciálne diskriminovať jednotlivcov, ktorí majú poškodené gény a ktoré by mohli viesť k vážnym zdravotným problémom.