Spektrofotometria je neoceniteľným nástrojom v chémii a biológii. Základná myšlienka je jednoduchá: rôzne látky absorbujú svetlo / elektromagnetické žiarenie lepšie na niektorých vlnových dĺžkach ako na iných. Preto sú niektoré materiály priehľadné, zatiaľ čo iné sú napríklad zafarbené. Keď svietite roztokom o danej vlnovej dĺžke, tým vyššia je jeho koncentrácia, tým viac svetla absorbuje. Ak chcete vypočítať koncentráciu, musíte porovnať svoje hodnoty s nameranými hodnotami pre štandardy známej koncentrácie. Nasledujúci postup je pomerne všeobecný postup napísaný s ohľadom na učebňu chemie, ale je možné ho upraviť aj pre ďalšie nastavenia.
Ako vždy pri práci v laboratóriu si na zaistenie vlastnej bezpečnosti oblečte ochranné okuliare, rukavice a plášť s dlhým rukávom.
Stlačením gumovej žiarovky vyprázdnite vzduch, potom ju umiestnite na vrchol svojej pipety s odstupňovanými stupňami a nechajte žiarovku relaxovať, aby nasala vodu do pipety. Potom vyberte žiarovku a prstom zakryte hornú časť pipety. toto utesní pipetu tak, aby roztok vo vnútri nevytekal, kým neodstránite prst. Mierne zdvihnite okraj prsta, aby z pipety vytieklo malé množstvo roztoku, až kým nedosiahnete požadovaný objem. Cvičte s trochou vody a kadičky, aby ste získali predstavu o tom, ako funguje odstupňovaná pipeta. Odkaz v sekcii Zdroje obsahuje filmový klip, ktorý vám ukáže, ako používať pipetu v prípade, že ste s ňou nikdy predtým nepracovali.
Označte 5 skúmaviek ako štandardy 1-5. Môžete ich označiť pomocou maskovacej pásky a pera alebo pomocou suchej fixky.
Vyberte päť koncentrácií pre vaše štandardy. Chcete, aby boli štandardné koncentrácie od seba navzájom oddelené približne rovnakým intervalom - napr. 0,1 molárny roztok, 0,2 molárny roztok, 0,3 molárny roztok atď. - a približne v rovnakom rozsahu, aký očakávate, že bude vaša neznáma. Zatiaľ použite nasledujúcich päť koncentrácií, ale nezabudnite, že pri uskutočňovaní vlastného experimentu ich budete musieť upraviť:
Štandard 1: 0,1 molárny Štandard 2: 0,2 molárny Štandardný 3: 0,3 molárny Štandardný 4: 0,4 mol Štandardný 5: 0,5 molárny
Ďalej vezmite 1 molárny štandardný roztok a pridajte nasledujúce množstvá do skúmaviek 1 až 5. Pamätajte, že tieto množstvá sa počítajú pomocou koncentrácií uvedených vyššie, takže pri uskutočňovaní vlastného experimentu bude pravdepodobne potrebné ich podľa potreby upraviť.
Štandard 1: 0,8 mililitra Štandard 2: 1,6 mililitra Štandard 3: 2,4 mililitra Štandard 4: 3,2 mililitra Štandard 5: 4 mililitre
Opláchnite odmernú pipetu a potom preneste nasledujúce množstvo deionizovanej vody:
Štandard 1: 7,2 mililitrov Štandard 2: 6,4 mililitrov Štandard 3: 5,6 mililitrov Štandard 4: 4,8 mililitrov Štandard 5: 4,0 mililitrov
V zásade ide o to, aby sa množstvo roztoku v každej skúmavke zvýšilo až na 8 mililitrov.
Uzavrite každú zo štandardných skúmaviek parafilmom a obráťte ich, aby sa premiešali.
Označte ďalších päť skúmaviek ako „Neznáme 1-5“. Pridajte ku každému rovnaké množstvo neznámeho alebo testovaného roztoku, aké ste použili s 1 molárnym roztokom pre štandardy. Inými slovami, neznáma 1 bude obsahovať 0,8 mililitra testovaného roztoku a 7,2 mililitrov voda, neznáma 2 bude obsahovať 1,6 mililitra testovaného roztoku a 6,4 mililitra vody atď ďalej.
Uzavrite každú z neznámych parafilmom a opatrne prevráťte a premiešajte.
Zapnite spektrofotometer a nechajte ho zahriať. Potrebná doba bude závisieť od modelu a výrobcu.
Na spektrofotometri nastavte vlnovú dĺžku. Vlnová dĺžka bude závisieť od typu chemikálie vo vašom experimente. Zatiaľ predpokladajme 500 nm, aj keď nezabudnite, že pri rôznych experimentoch to budete musieť zmeniť.
Kalibrujte svoj spektrofotometer. Postup kalibrácie sa bude líšiť v závislosti od zariadenia, ktoré používate. U modelu Spectronic 20, ktorý je bežným modelom výučby v laboratóriách, najskôr stroj nastavíte tak, aby ukazoval hodnotu „0 percent T“ keď nie je vložená žiadna kyveta, upravte ju tak, aby mala hodnotu „100% T“, keď je prázdna kyveta obsahujúca iba deionizovanú vodu naložený. Tieto postupy sa môžu líšiť v závislosti od typu stroja, ktorý používate, preto si pozrite podrobné pokyny v pokynoch výrobcu.
Po kalibrácii prístroja vezmite štandardnú 1 skúmavku a vylejte obsah do čistej kyvety, kým nedosiahne rysku naplnenia. Kyvetu utrite utierkou, aby ste odstránili akékoľvek odtlačky prstov alebo iné nečistoty. Vložte kyvetu do spektrofotometra a zaznamenajte hodnotu „% T“.
Tento postup opakujte pre všetkých 10 vzoriek. UPLATŇUJTE čistenie kyvety medzi vzorkami, aby ste sa ubezpečili, že vaše výsledky sú čo najpresnejšie.
Vezmite výsledky svojich štandardov a zadajte ich do tabuľkového / grafického programu, ako je Excel alebo OpenOffice.
Pomocou tabuľkového procesora vydelte 100 percent každou z hodnôt „% T“ pre štandardy a potom urobte protokol výsledku. Tento výpočet vám poskytne absorbanciu. Ak zadáte vzorec, váš tabuľkový program vykoná výpočet za vás.
Príklad: Ak je% T 50,6, vzorec, ktorý zadáte do tabuľkového procesora, bude tento:
denník (100 / 50,6)
Tabuľkový program vykoná aritmetiku.
To isté urobte pre všetkých päť neznámych / experimentálnych hodnôt.
Zaznamenajte hodnoty absorbancie pre všetkých päť štandardov s koncentráciou na osi x a absorbanciou na osi y. Pomocou tabuľkového programu prispôsobte tomuto grafu lineárnu rovnicu. Rovnica bude mať tvar y = mx + b. Väčšina tabuľkových programov bude mať funkciu lineárnej regresie. Podrobnosti o tom, ako používať funkciu lineárnej regresie, nájdete v používateľskej príručke k vášmu tabuľkovému programu.
Vezmite z tabuľkového programu rovnicu pre najvhodnejšiu priamku a vyriešte ju pre y odčítaním b od oboch strán a vydelením oboch strán m. Výsledok bude vyzerať nasledovne:
(y - b) / m = x
kde b a m sú hodnoty nájdené vaším tabuľkovým procesorom.
Skontrolujte svoje hodnoty absorbancie pre neznáme hodnoty a vyberte tri, ktoré spadajú zhruba do rovnakého rozsahu ako štandardy. Tieto tri hodnoty absorbancie použite pre zostávajúce výpočty. Ak všetkých päť spadá do rovnakého rozsahu ako štandardy, môžete namiesto nich použiť všetkých päť, musíte však použiť aspoň tri.
Pripojte každú z troch hodnôt absorbancie do svojej rovnice namiesto y. Pamätajte, že vaša rovnica bola v nasledujúcej podobe:
(y - b) / m = x
Takže budete chcieť vložiť hodnotu absorbancie pre každú neznámu do rovnice namiesto y a potom vypočítať x. Tento tabuľkový program môžete použiť na vykonanie tohto výpočtu a na jeho zrýchlenie. Teraz ste vypočítali koncentráciu sledovanej chemikálie v troch z vašich zriedených neznámych látok. Pôvodný roztok sa však zriedil, aby sa pripravili tieto neznáme látky, takže teraz musíte pracovať späť a vypočítať koncentráciu pôvodného roztoku na základe faktora riedenia.
Každá neznáma vzorka, ktorú ste vložili do spektrofotometra, bola zriedená iným množstvom. V dôsledku toho by ste teraz mali rozdeliť vypočítanú koncentráciu na základe absorbancie pre každé neznáme odčítanie takto:
Neznáme 1: Delenie 0,1 Neznáme 2: Delenie 0,2 Neznáme 3: Delenie 0,3 Neznáme 4: Delenie 0,4 Neznáme 5: Delenie 0,5
Pamätajte však, že tieto údaje vychádzajú z predpokladu, že používate zriedenia uvedené vyššie. Nezabudnite zmeniť tieto hodnoty, ak ste vzorky zriedili o iné množstvo.
Pridajte svoje výsledky dohromady a vydelte ich počtom výsledkov. Takto získate priemer. Toto číslo uveďte ako svoj nález pre koncentráciu pôvodného roztoku.
Veci, ktoré budete potrebovať
- Ceruzka
- Papier
- Kalkulačka
- Rukavice
- Okuliare
- Kabát s dlhým rukávom
- Spektrofotometer
- Sklenené kyvety
- Parafilm
- Kimwipes
- Deionizovaná voda
- Riešenie, ktoré chcete testovať (neznámej koncentrácie)
- 1 molárny štandardný roztok chemikálie prítomnej vo vašom testovacom roztoku
- Odmerná pipeta a žiarovka
- Skúmavky a stojan na skúmavky
- Kadička
Tipy
Tento postup môže znieť komplikovane, ale v skutočnosti je pomerne jednoduchý, hneď ako začnete. Skúste sa pozrieť na dve videá v sekcii Zdroje, aby ste sa oboznámili s týmto postupom.