Полимеразная цепная реакция или ПЦР - это метод фотокопирования одного фрагмента ДНК на множество фрагментов - экспоненциально много. Первым шагом в ПЦР является нагревание ДНК до денатурирования или плавления на отдельные нити. Структура ДНК подобна веревочной лестнице, ступеньки которой представляют собой веревки с магнитными концами. Магниты соединяются, образуя ступеньки, называемые парами оснований, и, таким образом, сопротивляются растяжению. Каждый фрагмент ДНК плавится на отдельные нити при разных температурах. Понимание того, как структура ДНК удерживается вместе отдельными частями ДНК, поможет понять, почему разные фрагменты ДНК плавятся при разных температурах и почему такие высокие температуры нужны в первую очередь место.
Таяние! Таяние!
Первым шагом ПЦР является плавление ДНК таким образом, чтобы двухцепочечная ДНК разделялась на одноцепочечную ДНК. Для ДНК млекопитающих этот первый шаг обычно включает нагрев примерно до 95 градусов по Цельсию (около 200 по Фаренгейту). При этой температуре водородные связи между парами оснований A-T и G-C, или ступеньками лестницы ДНК, разрываются, разрывая двухцепочечную ДНК. Однако температура недостаточно высока, чтобы сломать фосфатно-сахарный каркас, образующий отдельные нити или полюса лестницы. Полное разделение одиночных цепей подготавливает их ко второму этапу ПЦР, который охлаждается, чтобы позволить коротким фрагментам ДНК, называемым праймерами, связать одиночные цепи.
Магнитные молнии
Одна из причин, по которой ДНК нагревается до высокой температуры 95 градусов по Цельсию, заключается в том, что чем длиннее двойная цепь ДНК, тем больше она хочет оставаться вместе. Длина ДНК является одним из факторов, влияющих на точку плавления, выбранную для ПЦР на этом участке ДНК. Пары оснований A-T и G-C в двухцепочечной ДНК связываются друг с другом, чтобы удерживать вместе двухцепочечную структуру. Чем больше последовательных пар оснований между двумя однониточными цепями связали, тем больше их соседи также хотят связываться, и тем сильнее становится притяжение между двумя цепями. Это как молния из маленьких магнитов. Когда вы закроете молнию, магниты, естественно, захотят застегнуться и остаться на ней.
Более сильные магниты прилипают плотнее
Другой фактор, который влияет на то, какую температуру плавления выбрать для интересующего фрагмента ДНК, - это количество пар оснований G-C, присутствующих в этом фрагменте. Каждая базовая пара похожа на два притягивающих мини-магнита. Пара, состоящая из G и C, привлекает гораздо сильнее, чем пара A и T. Таким образом, фрагмент ДНК, который имеет больше пар G-C, чем другой фрагмент, потребует более высокой температуры перед тем, как расплавиться на отдельные нити. ДНК естественным образом поглощает ультрафиолетовый свет - точнее, на длине волны 260 нанометров - а одноцепочечная ДНК поглощает больше света, чем двухцепочечная ДНК. Таким образом, измерение количества поглощенного света - это способ измерить, насколько ваша двухцепочечная ДНК расплавилась в одноцепочечные. Эффект «магнитной застежки-молнии» пар оснований G-C и A-T - это то, что вызывает график светопоглощения двухцепочечная ДНК, построенная против повышения температуры, является сигмоидальной, имеет форму буквы S, а не буквы прямая линия. Кривая S представляет сопротивление совместной работы, которое пары оснований оказывают теплу, потому что они не хотят разделяться.
На полпути
Температура, при которой длина ДНК плавится в отдельные цепи, называется температурой плавления и обозначается аббревиатурой «Tm». Это указывает на температуру, при которой половина ДНК в растворе расплавилась на одноцепочечные, а другая половина все еще находится в двухцепочечном. форма. Температура плавления различна для каждого фрагмента ДНК. ДНК млекопитающих содержит 40% G-C, что означает, что оставшиеся 60% пар оснований представляют собой As и Ts. Его 40% -ное содержание G-C заставляет ДНК млекопитающих плавиться при температуре 87 градусов по Цельсию (около 189 по Фаренгейту). Вот почему первым шагом ПЦР на ДНК млекопитающих является нагревание до 94 градусов по Цельсию (201 по Фаренгейту). Всего на семь градусов выше температуры плавления, и все двойные нити полностью превратятся в одинарные.