Гель-электрофорез - это метод, при котором биологические молекулы отделяются друг от друга и идентифицируются в ходе биологических исследований или медицинской диагностики. С момента их разработки в 1970-х годах эти методы оказались бесценными для идентификации генов (ДНК) и генных продуктов (РНК и белков), представляющих исследовательский интерес. В последние годы появились новые методы, которые дают большую конкретность и детализацию того, что происходит в живых системах. Хотя они не вытеснили методы электрофореза, а продвинутые манипуляции могут расширить жизнеспособность метода, важно понимать, что гель-электрофорез может и чего не может.
Электрофоррез имеет ограниченный анализ образцов
Электрофорез специфичен для любой ткани, которую вы взяли. Например, если вы проведете Саузерн-блоттинг (разновидность электрофореза) мазка со щеки, вы увидите гены эпителиальных клеток вашей щеки и нигде больше в вашем теле. Иногда это может быть полезно, но исследователи часто интересуются более распространенными эффектами.
Такие методы, как гибридизация in situ (ISH), позволяют взять срез ткани и проанализировать экспрессию генов в каждой небольшой области этого образца. Таким образом, исследователи могут исследовать каждую область мозга в образце с помощью ISH, тогда как методы электрофореза могут исследовать только несколько областей одновременно.
Измерения электрофореза неточные
Гель-электрофорез может эффективно разделить похожие белки с разной массой (этот метод называется вестерн-блоттингом). Он может разделить их более точно с помощью метода, известного как 2d-электрофорез; это обычное дело в протеомике.
К сожалению, все измерения, сделанные с помощью этого метода, в лучшем случае являются полуколичественными. Чтобы получить точную массу (вес) белков, масс-спектроскопия должна использоваться после того, как белок был очищен электрофорезом. Кроме того, сравнение относительных количеств различных молекул зависит от плотности полос (темноты) различных пятен на геле. Этот метод имеет некоторую степень ошибки, и образцы обычно запускаются несколько раз, чтобы получить точные результаты.
Требуется значительный стартовый образец
Электрофорез - это метод выделения и визуальной идентификации различных биомолекул. Это делается путем пропускания электрического тока через гель для разделения заряженных молекул разного веса. Если интересующая вас молекула недостаточно распространена, ее полоса будет практически невидимой, и ее будет трудно измерить.
ДНК и РНК можно несколько амплифицировать перед проведением электрофореза, но это нецелесообразно делать с белками. Следовательно, для проведения этих анализов необходим большой образец ткани. Это может ограничить полезность метода, особенно в медицинском анализе. Практически невозможно провести электрофорез образцов из одной ячейки; проточная цитометрия и иммуногистохимия чаще используются для оценки экспрессии белков от клетки к клетке. Метод, называемый ПЦР, отлично подходит для точного измерения крошечных количеств РНК.
Можно визуализировать только определенные молекулы
Электрофорез отлично подходит для разделения и идентификации биомолекул среднего и большого размера. Однако многие молекулы, на которые хотят обратить внимание исследователи, меньше по размеру; малые гормоны, нейротрансмиттеры и ионы нельзя измерить с помощью электрофореза. Это происходит по двум причинам: они не реагируют должным образом с препаратом для электрофореза (обычно это методика называется SDS PAGE), и даже если бы они это сделали, они слишком малы для правильного разделения и выскочили бы из нижней части гель. Эти молекулы вместо этого измеряются такими методами, как RIAA (радиоиммуноанализ) и ELISA (иммуноферментный анализ).
Электрофорез - низкая пропускная способность
Гель-электрофорез, как правило, имеет низкую производительность, что означает, что он не дает данных особенно быстро. Контрастный электрофорез, при котором вы можете одновременно рассматривать небольшое количество молекул РНК, с ПЦР (полимеразной цепной реакцией), которая позволяет одновременно оценивать тысячи образцов. Точно так же проточная цитометрия может снимать измерения с тысяч отдельных клеток и делать сложные корреляции, в то время как электрофорез смотрит на клетки в массе и не может дискриминации. ПЦР и проточная цитометрия представляют собой массово параллельные и последовательные процессы, соответственно, и оба намного превосходят возможности электрофореза для получения данных исследований.