Когда дело доходит до измерения длины фрагментов ДНК, которые намного меньше, чем клетки, микробиологам нужен трюк, и самый удобный из них - гель-электрофорез. Этот метод основан на том, что фрагменты ДНК заряжены, и является альтернативой более дорогим методы, такие как рентгеновская кристаллография, которая была ответственна за открытие структуры двойной спирали ДНК.
Как работает гель-электрофорез
Поскольку молекулы ДНК заряжены, на них действует электрический ток. Когда вы помещаете их в нейтральный гель и пропускаете ток через гель, молекулы перемещаются к положительному электроду (аноду). Поскольку молекулы ДНК разного размера несут одинаковый заряд, более мелкие движутся быстрее, поэтому этот процесс разделяет молекулы на полосы, которые можно сравнить с образцами известных размеров.
Основная процедура электрофореза
Гель обычно изготавливается из агарозы, полисахарида, который при нагревании в буферном растворе образует полутвердый, слегка пористый гель. На одном конце гель образует крошечные углубления, называемые лунками, куда исследователь помещает исследуемые образцы ДНК вместе с эталонными образцами известной длины, называемыми лестницей ДНК. Длины фрагментов лестницы были предварительно определены другим методом, например рентгеновской кристаллографией.
Когда гель погружают в проводящий раствор и прикладывают напряжение, фрагменты начинают мигрировать через гель - сначала более мелкие, а затем более крупные и медленные. В конечном итоге они образуют спектрально-подобные полосы в зависимости от размера.
Как только это происходит, исследователь отключает питание, пропитывает гель DVA-связывающим красителем и исследует образцы в ультрафиолетовом свете. Используя лестницу в качестве ориентира, исследователь может определить размер каждого из фрагментов в видимой полосе. Видны только полосы - отдельные фрагменты ДНК слишком малы, чтобы их можно было увидеть.
Определение длины неизвестных фрагментов
Скорее всего, не каждая полоса в образце сочетается с полосой на лестнице, поэтому для определения размеров этих неизвестных фрагментов ученые обычно строят график. По оси абсцисс отложено расстояние, пройденное каждой полосой лестницы в миллиметрах, а по оси ординат - размер каждой полосы. Когда точки соединяются кривой, размер любой полосы можно экстраполировать из кривой после измерения расстояния, пройденного этой полосой в миллиметрах.