Ученым и техническим специалистам часто требуется рассчитать концентрацию клеток в суспензии. Например, когда у пациента берется кровь в кабинете врача, лаборатория может использовать определенные методы для определения количества лейкоцитов в заданном объеме крови. Это дает врачу много информации о состоянии здоровья пациента, особенно о его иммунной системе и о том, борется ли он с инфекцией или другим заболеванием. Подобные тесты могут искать многие другие клетки в крови, а также спинномозговую жидкость и другие жидкости организма, такие как количество сперматозоидов в сперме для целей фертильности. Ученые также рассчитывают концентрацию клеток бактерий, дрожжей и других микроорганизмов для множества целей, от экологических исследований до промышленных технологий. Один из наиболее распространенных методов также преподается на многих курсах биологии в колледжах, и он использует устройство, называемое счетной камерой.
Прежде чем клеточная суспензия попадет в счетную камеру, ей может потребоваться разбавление, поскольку она может содержать тысячи или миллионы клеток. В этом случае клетки не могут быть разумно подсчитаны. Чтобы разбавить образец, с помощью стерильной пипетки поместите десять микролитров клеточного раствора в пробирку, содержащую 90 микролитров разбавителя. Тип разбавителя будет зависеть от типа ячейки. Хорошо перемешайте. Этот раствор теперь в десять раз больше разбавлен, чем исходный образец, поэтому его коэффициент разбавления составляет 10.
Возможно, вам придется попробовать несколько разведений, чтобы определить правильный коэффициент разбавления для счетной камеры. Счетная камера представляет собой очень маленькую прозрачную прямоугольную коробку с точной глубиной и точной сеткой, нанесенной наверху. Он также известен как гемоцитометр или иногда гемацитометр. Цель состоит в том, чтобы суспензия была достаточно разбавленной, чтобы при просмотре ее в счетной камере не было перекрытия ячеек, и они равномерно распределялись по сетке. Пипетируйте разбавленную суспензию, содержащую клетки, в лунку счетной камеры, где она оседает в решетчатой камере за счет капиллярного действия. Поместите счетную камеру на предметный столик микроскопа и просматривайте ее при малом увеличении.
Сетка состоит из квадратов, которые состоят из квадратов еще меньшего размера. Выделите примерно четыре или пять квадратов или столько, сколько вам нужно, чтобы насчитать не менее 100 ячеек, в шаблоне по вашему выбору, например, четыре угла и центральный квадрат. Если ячейки большие, это могут быть большие квадраты, но если ячейки маленькие, вы можете вместо этого выбрать меньшие квадраты.
Удельный объем каждого квадрата сетки может варьироваться в зависимости от производителя счетной камеры, но часто глубина камеры составляет 0,1. миллиметров, площадь больших квадратов составляет 1 квадратный миллиметр, а площадь меньших квадратов составляет 0,04 кв. миллиметры. Таким образом, большие квадраты имеют объем 0,1 кубического миллиметра. В этом примере предположим, что вы насчитали всего 103 клетки в пяти квадратах и разбавили исходный образец до тех пор, пока коэффициент разбавления не станет 10.-2.
Если каждый квадрат сетки имеет объем 0,1 кубических миллиметра и было подсчитано пять, то общий объем подсчитанной камеры составлял 0,5 кубических миллиметра, и было 103 ячейки. Если увеличить его вдвое до 1 кубического миллиметра, получится 206 ячеек. Один кубический сантиметр эквивалентен 1 миллилитру, что удобно для жидкостей. В кубическом сантиметре 1000 кубических миллиметров. Следовательно, если бы имелся кубический сантиметр или миллилитр суспензии, вы бы насчитали 206 000 (206 x 1000) клеток. Вот как это выглядит в виде уравнения:
Объем квадрата сетки × количество подсчитанных квадратов = общий объем подсчитанной суспензии
Количество клеток ÷ объем подсчитанной суспензии = количество клеток на кубический миллиметр
Количество клеток на миллиметр в кубе × 1000 = количество клеток на миллилитр
Вам нужно будет учесть любое разбавление, чтобы можно было подсчитать исходный раствор под микроскопом. В этом примере коэффициент разбавления равен 10.-2. Чтобы рассчитать начальную концентрацию раствора:
Количество клеток на миллилитр ÷ коэффициент разбавления = Концентрация клеток
В этом примере количество клеток на миллилитр составляет 206000, и если разделить это на 10-2 (0,01) дает концентрацию 20 600 000 клеток на миллилитр в исходном образце.