Можно клонировать целые организмы, такие как овечка Долли, но клонирование ДНК - другое дело. Он использует методы молекулярной биологии, чтобы сделать идентичные копии последовательностей ДНК или отдельных генов.
С помощью методов генной инженерии идентифицируются и выделяются сегменты генетического кода ДНК. Затем клонирование ДНК копирует нуклеиновая кислота последовательности в сегментах.
Полученные идентичные копии можно использовать для дальнейших исследований или для биотехнологических приложений. Часто копируемый ген кодирует белок, который может использоваться при лечении. ДНК-технология, включая Клонирование ДНК поддерживает понимание того, как работают гены и как генетический код человека влияет на функционирование организма.
Клонирование ДНК: определение и обзор процесса
Клонирование ДНК - это процесс молекулярной биологии создания идентичных копий сегментов ДНК, расположенных в хромосомах, которые содержат генетический код передовых организмов.
В процессе генерируется большое количество
последовательности ДНК-мишени. Целью клонирования ДНК является получение самих целевых последовательностей ДНК или получение белков, кодируемых в целевых последовательностях.Два метода, используемые при клонировании ДНК, называются плазмидный вектор а также полимеразная цепная реакция (ПЦР). в плазмидный вектор методом, нити ДНК разрезаются с использованием рестрикционные ферменты для получения фрагментов ДНК, и полученные сегменты вставляют в векторы клонирования, называемые плазмидами, для дальнейшего дублирования. Плазмиды помещаются в бактериальные клетки, которые затем производят копии ДНК или кодируемые белки.
в Метод ПЦР, сегмент ДНК, подлежащий дублированию, помечается ферментами, называемыми грунтовки. Фермент полимераза копирует отмеченную часть цепи ДНК. Этот метод не использует рестрикционные ферменты и может производить клонированную ДНК из небольших образцов. Иногда два метода ДНК-технологии используются вместе, чтобы объединить лучшие черты каждого из них в общей реакции.
Метод плазмидных векторов
Вектор метода относится к плазмиде, используемой для удерживания клонируемого целевого сегмента ДНК. Плазмиды представляют собой небольшие круглые нити нехромосомная ДНК обнаружен во многих организмах, включая бактерии и вирусы.
Бактериальные плазмиды - это вектор, используемый для встраивания целевого сегмента ДНК в бактериальные клетки для дальнейшей дупликации.
Выбор и выделение целевой ДНК: Прежде чем можно будет начать процесс клонирования ДНК, необходимо идентифицировать последовательности ДНК, особенно начало и конец сегментов ДНК.
Такие последовательности ДНК можно найти, используя существующую клонированную ДНК с известными последовательностями или изучая белок, продуцируемый последовательностью ДНК-мишени. Как только последовательность известна, можно использовать соответствующие рестрикционные ферменты.
Нарезка целевой ДНК рестрикционными ферментами: Ферменты рестрикции выбираются для поиска кода ДНК в начале и конце целевых последовательностей.
Когда рестрикционные ферменты находят специальную кодируемую последовательность пар оснований, называемую сайтами рестрикции, они прикрепляются к ДНК в этом месте и обвиваются вокруг молекулы ДНК, разрывая прядь. Вырезанные сегменты ДНК, содержащие целевую последовательность, теперь доступны для дублирования.
Выбор плазмидного вектора и вставка целевой ДНК: Подходящая плазмида в идеале содержит те же кодирующие последовательности ДНК, что и цепь ДНК, из которой была вырезана целевая ДНК. Кольцевая цепь ДНК плазмиды разрезается теми же рестрикционными ферментами, которые использовались для разрезания целевой ДНК.
А Фермент ДНК-лигаза используется для содействия связыванию сегментов ДНК, и концы целевого сегмента ДНК соединяются с обрезанными концами плазмидной ДНК. Целевая ДНК теперь является частью кольцевой цепи плазмидной ДНК.
Вставка плазмиды в бактериальную клетку: Как только плазмида содержит последовательность ДНК, которая должна быть клонирована, фактическое клонирование может происходить с использованием процесса, называемого бактериальная трансформация. Плазмиды вставляются в бактериальную клетку, такую как E. coli, и клетки с новыми сегментами ДНК начнут производить копии и соответствующие белки.
При бактериальной трансформации клетки-хозяева и плазмиды инкубируют вместе при температуре тела в течение примерно 12 часов. Клетки поглощают часть плазмид и рассматривают их как собственную плазмидную ДНК.
Сбор клонированной ДНК и белков: Большинство плазмид, используемых для клонирования ДНК, имеют гены устойчивости к антибиотикам включены в их ДНК. По мере того как бактериальные клетки поглощают новые плазмиды, они становятся устойчивыми к антибиотикам.
Когда культура обрабатывается антибиотиками, выживают только те клетки, которые поглотили новые плазмиды. В результате получается чистая культура бактериальных клеток с клонированной ДНК. Затем эту ДНК можно собрать или получить соответствующий белок.
Метод ПЦР (полимеразная цепная реакция)
В ПЦР метод проще и копирует существующую ДНК на месте. Не требует резки рестрикционными ферментами или вставки плазмидаДНК последовательности. Это делает его особенно подходящим для клонирования образцов ДНК с ограниченным количеством нитей ДНК. Хотя этот метод позволяет клонировать ДНК, его нельзя использовать для производства соответствующего белка.
Размотка нитей ДНК: ДНК в хромосомах плотно свернута в структуру двойной спирали. Нагревание ДНК до 96 градусов Цельсия в процессе, называемом денатурация заставляет молекулу ДНК раскручиваться и разделяться на две нити. Это разделение необходимо, потому что за один раз можно клонировать только одну цепь ДНК.
Выбор праймеров: Как и в случае клонирования ДНК плазмидного вектора, клонируемые последовательности ДНК должны быть идентифицированы с особым акцентом на начало и конец сегментов ДНК. Праймеры - это ферменты, которые прикрепляются к определенным кодовым последовательностям ДНК, и их необходимо выбирать, чтобы маркировать целевые сегменты ДНК. Правильные праймеры будут прикрепляться к последовательностям молекул ДНК, чтобы отмечать начало и конец целевых сегментов.
Отжиг реакции на связывание праймеров: Охлаждение реакции примерно до 55 градусов Цельсия называется отжиг. По мере охлаждения реакции праймеры активируются и присоединяются к цепи ДНК на каждом конце целевого сегмента ДНК. Праймеры действуют только как маркеры, и цепь ДНК не нужно разрезать.
Получение идентичных копий целевого сегмента ДНК: В процессе, называемом расширение, в реакцию добавляется термочувствительный фермент полимераза TAQ. Затем реакционную смесь нагревают до 72 градусов Цельсия, активируя фермент. Активный фермент ДНК-полимераза связывается с праймерами и копирует последовательность ДНК между ними. Первоначальный процесс секвенирования и клонирования ДНК завершен.
Увеличение выхода клонированной ДНК: Первоначальный процесс отжига и удлинения создает относительно небольшое количество копий доступных сегментов цепи ДНК. Чтобы увеличить выход за счет дополнительной репликации ДНК, реакционную смесь снова охлаждают, чтобы повторно активировать праймеры и позволить им связываться с другими цепями ДНК.
Затем повторный нагрев реакционной смеси снова активирует фермент полимеразу и производит больше копий. Этот цикл можно повторить от 25 до 30 раз.
Совместное использование плазмидного вектора и методов клонирования ДНК ПЦР
Метод плазмидного вектора основан на достаточном начальном запасе ДНК для разрезания и вставки в плазмиды. Слишком мало исходной ДНК приводит к меньшему количеству плазмид и медленному началу производства клонированной ДНК.
Метод ПЦР позволяет получить большое количество ДНК из нескольких исходных цепей ДНК, но поскольку ДНК не имплантирована в бактериальную клетку, производство белка невозможно.
Для получения белка, кодируемого фрагментами ДНК, которые необходимо клонировать, из небольшого исходного образца ДНК, эти два метода можно использовать вместе, и они могут дополняют друг друга. Сначала метод ПЦР используется для клонирования ДНК из небольшого образца и получения множества копий.
Затем продукты ПЦР используются с методом плазмидного вектора для имплантации полученной ДНК в бактериальные клетки, которые будут продуцировать желаемый белок.
Примеры клонирования ДНК для биотехнологии
Молекулярная биология использует клонирование генов и репликацию ДНК в медицинских и коммерческих целях. Бактерии с клонированными последовательностями ДНК используются для производства лекарств и замены веществ, которые люди с генетическими нарушениями не могут производить сами.
Типичные применения включают:
- Ген для человеческий инсулин клонируется в бактериях, которые затем производят инсулин, используемый диабетиками.
- Активатор тканевого плазминогена производится из клонированной ДНК и используется для помощи предотвратить образование тромбов.
- Гормон роста человека могут быть произведены и предоставлены людям, которые не могут производить их сами.
Биотехнология также использует клонирование генов в сельском хозяйстве для создания новых характеристик растений и животных или улучшения существующих характеристик. По мере клонирования большего количества генов количество возможных применений увеличивается в геометрической прогрессии.
Примеры клонирования ДНК для исследований
Молекулы ДНК составляют небольшую часть материала в живой клетке, и трудно изолировать влияние многих генов. Методы клонирования ДНК доставляют большие количества определенной последовательности ДНК для изучения, и ДНК производит белки так же, как и в исходной клетке. Клонирование ДНК позволяет изучать эту операцию изолированно для разных генов.
Типичные применения в исследованиях и технологиях ДНК включают изучение:
- Функция гена.
- Мутации гена.
- Экспрессия гена.
- Генные продукты.
- Генетические дефекты.
Когда клонируется больше последовательностей ДНК, легче найти и клонировать дополнительные последовательности. Существующие клонированные сегменты ДНК можно использовать, чтобы определить, совпадает ли новый сегмент со старым и какие части отличаются. Тогда идентификация целевой последовательности ДНК будет быстрее и точнее.
Примеры клонирования ДНК для генной терапии
В генная терапия, клонированный ген представлен клеткам организма, чей естественный ген поврежден. Жизненно важный ген, который производит белок, необходимый для определенной функции организма, может быть мутирован, изменен радиацией или затронут вирусами.
Когда ген не работает должным образом, в клетке отсутствует важное вещество. Генная терапия пытается заменить ген клонированной версией, которая будет производить необходимое вещество.
Генная терапия все еще является экспериментальной, и лишь немногие пациенты были излечены с помощью этой техники. Проблемы заключаются в идентификации единственного гена, ответственного за заболевание, и доставке множества копий гена в нужные клетки. Поскольку клонирование ДНК стало более распространенным, генная терапия применялась в нескольких конкретных ситуациях.
Недавние успешные заявки включали:
- Болезнь Паркинсона: Используя вирус в качестве вектора, ген, связанный с болезнью Паркинсона, вводили в средний мозг пациентов. У пациентов улучшилась моторика без каких-либо побочных эффектов.
- Недостаток аденозиндезаминазы (ADA): Генетическое иммунное заболевание лечили путем удаления стволовых клеток крови пациентов и вставки гена ADA. В результате пациенты могли производить по крайней мере часть своей собственной ADA.
- Гемофилия: Люди с гемофилией не производят специфических белков, которые помогают свертыванию крови. Ген, вырабатывающий один из недостающих белков, был вставлен в клетки печени пациентов. Пациенты вырабатывали белок, и количество случаев кровотечения сократилось.
Генная терапия - одно из самых многообещающих применений клонирования ДНК, но другие новые применения, вероятно, будут распространяться по мере изучения большего количества последовательностей ДНК и определения их функции. Клонирование ДНК дает сырье для генной инженерии в необходимых количествах.
Когда роль генов известна и их правильная функция может быть обеспечена путем замены дефектных гены, многие хронические заболевания и даже рак можно атаковать и лечить на генетическом уровне с помощью ДНК технология.
Связанное содержание:
- Характеристики колоний кишечной палочки (Escherichia Coli)
- РНК: определение, функция, структура
