Вестерн-блоттинг, аналитический метод, используемый для точного определения конкретного белка в данном образце, использует способность фермента или флуоресцентно меченного первичного антитела связываться со своим специфическим антигеном. Это трехэтапный процесс, начинающийся с гель-электрофореза, за которым следует мембранный блоттинг и зондирование с помощью антител. Обнаружение белка может быть прямым или непрямым, причем последнее с использованием меченых вторичных антител, направленных против первичного. Несмотря на то, что вестерн-блот считается обычным методом анализа белков, он имеет как ограничения, так и преимущества.
Преимущество: чувствительность
Один из главных аргументов в пользу вестерн-блоттинга - его чувствительность. Благодаря своей способности обнаруживать в образце всего 0,1 нанограмма белка, этот метод теоретически может служить эффективный инструмент ранней диагностики, обнаруживающий даже малейший иммуногенный ответ от вируса или бактерий у пациента образец. Непрямой вестерн-блот дополнительно основывается на этой чувствительности благодаря способности вторичного антитела усиливать интенсивность сигнала, обнаруживаемого системой визуализации. Большая чувствительность означает, что для тестирования требуется меньше антител, что значительно сокращает лабораторные расходы.
Преимущество: специфичность
Техника вестерн-блоттинга обязана своей спецификой двум важным факторам. Во-первых, гель-электрофорез сортирует образец на белки разного размера, заряда и конформации. Этот процесс сам по себе является огромным шагом к обнаружению, поскольку полосы, образующиеся в геле, уже дают представление о размере интересующего белка или полипептида. Специфичность взаимодействия антитело-антиген служит вторым важным фактором. Поскольку специфические антитела проявляют сродство к определенным белкам, процесс может выборочно обнаруживать целевой белок даже в смеси из 300 000 различных белков.
Недостаток: склонность к ложным или субъективным результатам.
Несмотря на свою чувствительность и специфичность, вестерн-блоттинг может давать ошибочные результаты. Ложноположительные результаты, когда антитело реагирует с нежелательным белком, что часто бывает происходит, когда у пациента, проходящего тестирование на ВИЧ, оказывается туберкулез или несколько паразитарных инфекции. С другой стороны, ложноотрицательный результат может легко возникнуть, если более крупным белкам не дать достаточно времени для надлежащего переноса на мембрану. Неправильное блоттинг и обработка часто приводят к искажению, блеклости или даже множеству полос, что делает результаты теста зависимыми от интерпретации технического специалиста.
Недостаток: высокая стоимость и техническая потребность.
Стоимость вестерн-блоттинга складывается из крупных индивидуальных затрат на меченые антитела, квалифицированных аналитиков и лабораторное оборудование. Деликатный процесс, вестерн-блоттинг, требует точности на каждом этапе для правильной идентификации компонентов образца. Незначительная ошибка в концентрации реагента или во время инкубационного периода может иметь катастрофические последствия для всего процесса. Наконец, оборудование, необходимое для обнаружения и визуализации - хемилюминесцентные, флуоресцентные, радиоактивные или лазерные системы обнаружения - может быть слишком дорогим для среднего микробиологического отделения.