Секвенирование ДНК: определение, методы, примеры

Нуклеотиды являются химическими строительными блоками жизни и находятся в ДНК живых организмов. Каждый нуклеотид состоит из сахар, фосфат и азотсодержащее основание: аденин (A), тимин (T), цитозин (C) и гуанин (G). Конкретный порядок этих нуклеотидных оснований определяет, какие белки, ферменты и молекулы будут синтезироваться клеткой.

Определение порядка или последовательности нуклеотидов важно для изучения мутации, эволюция, прогрессирование болезни, генетическое тестирование, судебно-медицинская экспертиза и медицина.

Геномика это изучение ДНК, генов, взаимодействия генов и влияния окружающей среды на гены. Секрет разгадки сложной внутренней работы генов заключается в возможности идентифицировать их структуру и расположение на хромосомах.

План живых организмов определяется порядком (или последовательностью) пар оснований нуклеиновых кислот в ДНК. Когда ДНК реплицируется, аденин соединяется с тимином, а цитозин - с гуанином; несовпадающие пары считаются мутации.

Поскольку двойная спираль дезоксирибонуклеиновая кислота Молекула (ДНК) была концептуализирована в 1953 году, значительные улучшения были сделаны в области геномики и крупномасштабного секвенирования ДНК. Ученые прилагают все усилия, чтобы применить эти новые знания для индивидуального лечения заболеваний.

В то же время продолжающиеся дискуссии позволяют исследователям опережать этические последствия таких стремительно развивающихся технологий.

Секвенирование ДНК - это процесс обнаружения последовательности различных нуклеотидных оснований в фрагментах ДНК. Секвенирование всего гена позволяет сравнивать хромосомы и геномы одного и того же и разных видов.

Картирование хромосом полезно для научных исследований. Анализируя механизмы и структуру геныАллели и хромосомные мутации в молекулах ДНК предлагают новые способы лечения генетических нарушений и, например, остановки роста раковых опухолей.

Методы секвенирования ДНК Фредерика Сэнгера значительно продвинулся в области геномики, начиная с 1970-х годов. Сэнгер почувствовал себя готовым заняться секвенированием ДНК после успешного секвенирования РНК при изучении инсулина. Сэнгер был не первым ученым, который занялся секвенированием ДНК. Однако его умные методы секвенирования ДНК, разработанные в тандеме с коллегами Бергом и Гилбертом, в 1980 году были удостоены Нобелевской премии.

Сэнгер знал потенциальную ценность своей работы и часто сотрудничал с другими учеными, разделявшими его интересы в области ДНК. молекулярная биология и науки о жизни.

Хотя методы секвенирования ДНК Сэнгера были медленными и дорогими по сравнению с современными технологиями секвенирования, в то время их хвалили. После проб и ошибок Сэнджер нашел секретный биохимический «рецепт» разделения цепей ДНК, создания большего количества ДНК и определения порядка нуклеотидов в геноме.

Для лабораторных исследований можно легко приобрести качественные материалы:

• ДНК-полимераза это фермент, необходимый для производства ДНК.
• Праймер ДНК сообщает ферменту, где начать работу с цепью ДНК.
• дНТФ представляют собой органические молекулы, состоящие из дезоксирибозного сахара и нуклеозидтрифосфатов - дАТФ, дГТФ, дЦТФ а также dTTP - которые собирают белки
• Цепи-терминаторы представляют собой окрашенные красителем нуклеотиды, также называемые терминаторными нуклеотидами для каждого основания - A, T, C и G.

Сэнгер придумал, как разрезать ДНК на небольшие сегменты с помощью фермента ДНК-полимеразы.

Затем он сделал еще ДНК из шаблона и вставил радиоактивные индикаторы в новую ДНК, чтобы разграничить участки разделенных цепей. Он также признал, что ферменту нужен праймер, который мог бы связываться с определенным местом на цепи матрицы. В 1981 году Сэнгер снова вошел в историю, выяснив геном митохондриальной ДНК из 16 000 пар оснований.

Температуру необходимо тщательно регулировать на протяжении всего процесса секвенирования. Сначала в трубку добавляют химикаты и нагревают, чтобы распутать (денатурировать) двухцепочечный Молекула ДНК. Затем температура снижается, позволяя грунтовке склеиться.

Затем температура повышается, чтобы стимулировать оптимальную активность ДНК-полимеразы (фермента).

Полимераза обычно использует доступные нормальные нуклеотиды, которые добавляются в более высокой концентрации. Когда полимераза достигает «концевого конца цепи» связанного с красителем нуклеотида, полимераза останавливается, и цепь заканчивается там, что объясняет, почему окрашенные нуклеотиды называются «концевыми цепями» или "Терминаторы".

Этот процесс продолжается много-много раз. В конце концов, связанный с красителем нуклеотид был помещен в каждую позицию последовательности ДНК. Затем гель-электрофорез и компьютерные программы могут идентифицировать цвета красителя на каждой из нитей ДНК и выяснить всю последовательность ДНК на основе красителя, положения красителя и длины пряди.

Секвенирование с высокой пропускной способностью - обычно называют секвенирование следующего поколения - использует новые достижения и технологии для более быстрой и дешевой секвенирования нуклеотидных оснований, чем когда-либо прежде. Машина для секвенирования ДНК может легко обрабатывать большие участки ДНК. Фактически, с помощью методов секвенирования Сэнгера целиком геном можно создать за считанные часы, а не за годы.

Методы секвенирования нового поколения могут обрабатывать анализ ДНК большого объема без дополнительного этапа амплификации или клонирования, чтобы получить достаточно ДНК для секвенирования. Машины для секвенирования ДНК одновременно выполняют несколько реакций секвенирования, что дешевле и быстрее.

По сути, новая технология секвенирования ДНК запускает сотни реакций Сэнгера на небольшом, легко читаемом микрочипе, который затем запускается компьютерной программой, собирающей последовательность.

Этот метод считывает более короткие фрагменты ДНК, но он все же быстрее и эффективнее, чем методы секвенирования Сэнгера, поэтому даже крупномасштабные проекты можно быстро завершить.

В Проект "Геном человека", завершенное в 2003 году, является одним из самых известных на сегодняшний день исследований секвенирования. Согласно статье 2018 г. Новости науки, геном человека состоит примерно из 46 831 ген, что было серьезной проблемой для последовательности. Лучшие ученые со всего мира потратили почти 10 лет на сотрудничество и консультации. Под руководством Национального исследования генома человека

Институт, проект успешно нанес на карту геном человека, используя составной образец, взятый у анонимных доноров крови.

Проект «Геном человека» опирался на методы секвенирования бактериальных искусственных хромосом (на основе ВАС) для картирования пар оснований. В этом методе использовались бактерии для клонирования фрагментов ДНК, что приводило к образованию большого количества ДНК для секвенирования. Затем клоны были уменьшены в размере, помещены в секвенатор и собраны в отрезки, представляющие ДНК человека.

Новые открытия в геномике коренным образом меняют подходы к профилактике, обнаружению и лечению заболеваний. Правительство выделило миллиарды долларов на исследования ДНК. Правоохранительные органы полагаются на анализ ДНК для раскрытия дел. Наборы для тестирования ДНК можно приобрести для домашнего использования, чтобы исследовать родословную и определить варианты генов, которые могут представлять опасность для здоровья:

• Геномный анализ влечет за собой сравнение и сопоставление последовательностей генома многих различных видов в областях и царствах жизни. Секвенирование ДНК может выявить генетические закономерности, которые проливают новый свет на то, когда определенные последовательности были введены эволюционным путем. Происхождение и миграцию можно проследить с помощью анализа ДНК и сравнить с историческими записями.

• Достижения медицины происходят с экспоненциальной скоростью, потому что практически каждое человеческое заболевание имеет генетический компонент. Секвенирование ДНК помогает ученым и врачам понять, как несколько генов взаимодействуют друг с другом и с окружающей средой. Быстрое секвенирование ДНК нового микроба, вызывающего вспышку заболевания, может помочь определить эффективные лекарства и вакцины до того, как проблема станет серьезной проблемой для общественного здравоохранения. Варианты генов в раковых клетках и опухолях можно секвенировать и использовать для разработки индивидуализированных методов лечения генов.

• Криминалистика приложения использовались, чтобы помочь правоохранительным органам раскрыть тысячи сложных дел с конца 1980-х годов, согласно Национальный институт юстиции. Доказательства на месте преступления могут содержать образцы ДНК из костей, волос или тканей тела, которые можно сравнить с профилем ДНК подозреваемого, чтобы помочь определить вину или невиновность. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - это широко используемый метод для создания копий ДНК из следов до секвенирования.

• Секвенирование вновь обнаруженных видов может помочь определить, какие другие виды наиболее близки, и раскрыть информацию об эволюции. Таксономисты используют «штрих-коды» ДНК для классификации организмов. Согласно Университет Джорджии в мае 2018 года еще предстоит обнаружить 303 вида млекопитающих.

• Генетическое тестирование на болезни ищите варианты мутировавших генов. Большинство из них представляют собой однонуклеотидные полиморфизмы (SNP), что означает, что только один нуклеотид в последовательности отличается от «нормальной» версии. Факторы окружающей среды и образ жизни влияют на то, как и если экспрессируются определенные гены. Глобальные компании делают передовые технологии секвенирования нового поколения доступными для исследователей по всему миру, заинтересованных в межгенных взаимодействиях и секвенировании всего генома.

• Наборы генеалогической ДНК использовать последовательности ДНК в своей базе данных для проверки вариантов в генах человека. Для набора требуется образец слюны или мазок из щеки, который отправляется по почте в коммерческую лабораторию для анализа. В дополнение к информации о происхождении некоторые наборы могут идентифицировать однонуклеотидные полиморфизмы (SNP) или другие хорошо известные генетические варианты, такие как гены BRCA1 и BRCA2, связанные с повышенным риском для женской груди и рак яичников.

Новые технологии часто могут принести не только вред, но и принести пользу обществу; примеры включают неисправные атомные электростанции и ядерное оружие массового уничтожения. Технологии ДНК тоже сопряжены с риском.

Эмоциональные опасения по поводу инструментов секвенирования ДНК и редактирования генов, таких как CRISPR, включают опасения, что технология может облегчить клонирование человека или привести к появлению мутантных трансгенных животных, созданных мошенниками. ученый.

Чаще всего этические вопросы, связанные с секвенированием ДНК, связаны с осознанным согласием. Легкий доступ к прямому тестированию ДНК потребителя означает, что потребители могут не полностью понимать, как их генетическая информация будет использоваться, храниться и передаваться. Непрофессионалы могут быть эмоционально не готовы узнать о своих дефектных генах и рисках для здоровья.

Третьи стороны, такие как работодатели и страховые компании, могут потенциально дискриминировать лиц, несущих дефектные гены, что может вызвать серьезные медицинские проблемы.