Согласно веб-сайту BioWeb Университета Висконсина, праймер для ПЦР представляет собой короткий синтетический олигонуклеотид (обычно между 18 длиной до 25 оснований), используемый для амплификации определенных участков ДНК в методике молекулярной биологии, известной как полимеразная цепная реакция (ПЦР). Необходимы как прямой, так и обратный праймеры, сконструированные как обратные комплементы цепи ДНК, фланкировать и связываться с желаемой областью ДНК. Когда ученые хотят провести исследование определенного гена или участка ДНК, им сначала необходимо выполнить ПЦР, чтобы получить достаточное количество целевого участка для работы. Создание последовательностей праймеров для интересующей области может быть необходимо, если они еще не доступны в результате ранее опубликованных исследований или с помощью коммерческих средств.
Получите нуклеотидную последовательность интересующего гена или участка ДНК и решите, какой длины фрагмент вы хотите амплифицировать. Прямой и обратный праймеры предназначены для связывания в начале и в конце желаемого фрагмента. Обычно в обычных методах ПЦР используются праймеры, фланкирующие область длиной от 100 до 1000 пар оснований, тогда как в методах ПЦР в реальном времени используются фрагменты длиной от 50 до 200 пар оснований.
Решите, в какой части последовательности вы хотите разместить праймеры. Например, вам может понадобиться место рядом с 5-футовым или 3-футовым концом последовательности или посередине. При желании укажите расположение праймеров для охвата интрона.
Дизайн-праймеры должны иметь длину от 18 до 24 оснований. Винсент Р. Prezioso, Ph. D., из Brinkmann Instruments Inc., предполагает, что эта длина достаточно велика, чтобы быть чрезвычайно специфичной для желаемой области ДНК, но достаточно короткой, чтобы легко связываться (отжигаться). Температура плавления праймера (Tm) должна быть от 55 до 80 градусов Цельсия, достаточно низкой, чтобы обеспечить полное плавление при температуре 90 градусов Цельсия или выше, но достаточно высокой, чтобы обеспечить возможность отжига. Содержание GC (процентное содержание Gs и Cs в последовательности) должно составлять от 40 до 60 процентов. 3'-конец последовательности праймера должен заканчиваться на C или G (называемый зажимом GC), чтобы способствовать связыванию, поскольку G и C нуклеотиды имеют более прочные связи, однако избегайте наличия трех или более G или C в последних пяти основаниях последовательности.
Избегайте запусков четырех или более из одного основания (например, ACCCC ...) или четырех или более динуклеотидных повторов (например, ATATATAT ...), потому что они могут вызвать ошибочное зачисление. Создавайте праймеры без гомологии внутри праймеров (более трех оснований, дополняющих одно основание). сам праймер) или межпраймерная гомология (где прямой и обратный праймеры имеют комплементарный последовательности). Это может вызвать самодимеры или димеры праймеров, где праймеры связываются сами с собой вместо связывания с желаемой последовательностью ДНК.
Используйте онлайн-ресурсы и веб-сайты, которые помогают в разработке праймеров или помогают проверить последовательности праймеров на самокомплементарность или возможность образования вторичных структур, таких как шпильки. Некоторые веб-сайты по разработке праймеров включают Primer3 Массачусетского технологического института, Primer-Blast Национального центра биотехнологической информации и OligoAnalyzer от Integrated DNA Technologies.