Источник рестрикционных ферментов

С момента открытия рестрикционных ферментов область молекулярной биологии быстро продвинулась вперед благодаря уникальной способности этих белков расщеплять ДНК определенным образом. Эти простые ферменты оказали огромное влияние на исследования во всем мире; как ни странно, у нас есть бактерии, которых нужно благодарить за этот научный дар.

Ферменты рестрикции, также называемые эндонуклеазами рестрикции, связываются с ДНК и расщепляют двойную цепь, образуя более мелкие фрагменты ДНК. Есть три типа рестрикционных ферментов; Ферменты рестрикции типа I распознают последовательность ДНК и случайным образом разрезают цепь на расстоянии более тысячи пар оснований от сайта. Ферменты рестрикции типа II, наиболее полезные для лабораторий молекулярной биологии, распознают и разрезают цепь ДНК предсказуемо по определенной последовательности, которая обычно составляет менее десяти пар оснований. Ферменты рестрикции типа III аналогичны ферментам типа I, но они отрезают ДНК примерно на тридцать пар оснований от последовательности распознавания.

Виды бактерий являются основным источником коммерческих рестрикционных ферментов. Эти ферменты служат для защиты бактериальных клеток от инвазии чужеродной ДНК, такой как последовательности нуклеиновых кислот, используемые вирусами для репликации внутри клетки-хозяина. По сути, фермент будет расщеплять ДНК на гораздо более мелкие части, которые не представляют опасности для клетки. Ферменты названы в честь видов и штаммов бактерий, которые их продуцируют. Например, первый рестрикционный фермент, экстрагированный из штамма Escherichia coli RY13, называется EcoRI, а пятый фермент, экстрагированный из того же вида, называется EcoRV.

Ферменты рестрикции типа II используются почти повсеместно в лабораториях по всему миру. Молекулы ДНК чрезвычайно длинные, и ими сложно управлять должным образом, особенно если исследователя интересуют только один или два гена. Ферменты рестрикции позволяют ученым надежно разрезать ДНК на гораздо меньшие части. Эта способность манипулировать ДНК позволила продвинуть рестрикционное картирование и молекулярное клонирование.

В лабораторных условиях очень полезно и удобно знать, где именно находятся определенные сайты рестрикции на цепи ДНК. Если последовательность ДНК известна, рестрикционное картирование может быть выполнено с помощью компьютера, который может быстро отобразить все возможные последовательности распознавания рестрикционного фермента. Если последовательность ДНК неизвестна, исследователь может создать общую карту, используя разные ферменты сами по себе и в сочетании с другими ферментами для расщепления молекулы. Используя дедуктивные рассуждения, можно создать общую карту ограничений. Наличие ограничительной карты имеет решающее значение при клонировании генов.

Молекулярное клонирование - это лабораторный метод, при котором ген вырезается из целевой молекулы ДНК, обычно извлекаемой из организма, рестрикционными ферментами. Затем ген вставляется в молекулу, называемую вектором, которая обычно представляет собой небольшие фрагменты кольцевая ДНК, называемая плазмидами, которые были модифицированы, чтобы нести несколько мишеней рестрикционных ферментов последовательности. Вектор расщепляется рестрикционными ферментами, а затем ген вставляется в кольцевую ДНК. Затем фермент под названием ДНК-лигаза может преобразовать круг, включив в него целевой ген. Как только ген «клонирован» таким образом, вектор можно вставить в бактериальную клетку, чтобы ген мог продуцировать белок.