Генетический план клетки закодирован в ее генетическом материале или ДНК. Поскольку ДНК никогда не покидает ядро клетки, чтобы эта информация попала в цитоплазму, где другие белков и биохимических компонентов, необходимо сначала транскрибировать ДНК в информационную РНК (мРНК или поли (А) РНК). Затем эта мРНК транслируется в белки, которые выполняют многие функции клетки. Для обнаружения или количественной оценки очень редких мРНК, создания зондов для микрочипов или создания библиотек комплементарных молекул ДНК необходимо выделить мРНК. Однако экстракция всей РНК (т.е. всей РНК в клетке) и последующее выделение мРНК не являются взаимоисключающими процессами; первое должно быть выполнено для извлечения мРНК.
Гомогенизация TRIzol: общая РНК включает всю мРНК, транспортную РНК, рибосомную РНК и другие некодирующие РНК. Чтобы отделить их от других клеточных компонентов, клетку сначала взрывают, чтобы высвободить ее. содержание. Это достигается путем ресуспендирования клеток, осажденных центрифугированием (вращением на высоких скоростях) в реагенте TRIzol (Life Technologies). Другие версии TRIzol (например, TRI Reagent Ambion) работают аналогично.
Выделение тотальной РНК: серия центрифугирования используется для разделения различных компонентов (белков, ДНК, РНК) клетки на слои или фазы в суспензии. Верхняя фаза желтого цвета состоит из жира, и от нее можно отказаться. Желаемая фаза окрашена в красный цвет, содержит всю РНК и сохраняется. После выполнения экстракции фенол-хлороформ и серии промывок спиртом с использованием изопропанола и этанола, РНК может быть осаждена для выделения мРНК. Добавьте ингибиторы РНКазы, чтобы предотвратить разрушение этим ферментом всей РНК.
Извлечение мРНК: обычно используют набор для выделения мРНК, поскольку домашние лабораторные протоколы не генерируют больших количеств высокоочищенных мРНК. Коммерческие наборы включают Invitrogen’s FastTrack 2.0 или Ambion’s Poly (A) Pure mRNA Isolation. Набор. Эти базовые шаги являются общими для таких комплектов:
г) Центрифугируйте этот образец и извлеките супернатант, который промывают несколько раз в сериях буферов для связывания и с низким содержанием соли, предусмотренных в наборах.
Рекомендации
- «Протоколы библиотеки кДНК?»; Ян Г. Коуэлл и Кэролайн А. Остин; 1997
- «Протоколы транскрипции и трансляции in vitro?»; Мартин Дж. Тиммс; 1995
Советы
- Охладите все реагенты, клетки и РНК, погрузив их в лед. Это предотвращает разрушение РНК любыми другими ферментами, которые высвобождаются в процессе гомогенизации.
Предупреждения
- Такие реагенты, как TRIzol, токсичны и не должны попадать на кожу или слизистые оболочки. Всегда соблюдайте безопасные лабораторные протоколы при работе с этим реагентом.
об авторе
Палмер Оуён имеет степень магистра международного бизнеса Калифорнийского университета в Сан-Диего и степень магистра в области международного бизнеса. Бакалавр социологии Калифорнийского университета в Санта-Барбаре. биолог. Он был писателем-фрилансером с 2006 года. Помимо писательского мастерства, он является постоянным трейдером Форекс и интернет-маркетологом.
Фото Кредиты
Jupiterimages / Photos.com / Getty Images