При работе с высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) правильная калибровка абсолютно необходима для обеспечения надежных и качественных результатов. Правильная калибровка прибора для ВЭЖХ начинается с создания подходящего калибровочного стандарта. В большинстве случаев для калибровки фактически требуется серия стандартов с возрастающей концентрацией, чтобы получить так называемую калибровочную кривую. Это построенная на графике линия и соответствующее уравнение, которое описывает взаимосвязь между концентрацией исследуемого химического вещества и откликом детектора ВЭЖХ.
Определите химическое вещество, которое вы хотите проверить с помощью ВЭЖХ («аналит»). Например, вы можете проверить серию безалкогольных напитков на содержание фруктозы, и в этом случае фруктоза будет аналитом.
Получите определенное количество аналита подходящей чистоты. Обычно чистота должна быть выше 99%, и аналит следует приобретать в известной компании-поставщике химикатов. В случае фруктозы, например, вы должны покупать чистую фруктозу у продавца химикатов, а не в продуктовом магазине.
Определите максимальную и минимальную ожидаемые концентрации аналита в образцах, которые вы собираетесь тестировать с помощью ВЭЖХ. В случае безалкогольных напитков вы должны изучить этикетки напитков и определить самое низкое и самое высокое содержание фруктозы среди напитков, которые вы будете тестировать. Помните, что исходный образец (безалкогольный напиток) может быть разбавлен или подвергнут другим манипуляциям во время подготовки к анализу. (в зависимости от используемого метода ВЭЖХ), поэтому концентрация аналита в образцах, фактически введенных в ВЭЖХ, может быть изменен. Следует учитывать концентрацию анализируемого вещества в образцах при анализе ВЭЖХ.
Определите растворитель, в котором вы будете растворять аналит для создания калибровочных стандартов. Этот растворитель должен уметь правильно растворять аналит в относительно широком диапазоне концентраций (по крайней мере, таких же высоких, как в образцах, которые вы собираетесь тестировать). Кроме того, этот растворитель в идеале должен быть очень похож на «подвижную фазу»: растворитель, используемый для переноса образцов через прибор для ВЭЖХ.
Рассчитайте количество аналита, необходимое для приготовления «стандартного» раствора аналита. Его можно найти, умножив требуемую концентрацию исходного стандарта на желаемый объем. Концентрация аналита в этом растворе должна быть как минимум на 10% выше, чем максимальная ожидаемая концентрация образца. Если наивысшая ожидаемая концентрация фруктозы в образце безалкогольного напитка составляет 8 граммов / 100 миллилитров, то стандартный стандарт может быть доведен до концентрации 10 граммов фруктозы / 100 миллилитров. Разумный объем составляет 500 миллилитров, поэтому потребуется 8/100 мл x 500 мл = 40 граммов фруктозы.
Взвесьте необходимое количество аналита с подходящей точностью. Часто подходит значение веса в граммах с точностью до одного или двух десятичных знаков, но для некоторых методов может потребоваться более высокая точность.
Перенесите навеску аналита в мерную колбу необходимого объема и добавьте желаемый растворитель до отметки заполнения на колбе. Использование мерной колбы (например, а не градуированного стакана) увеличивает точность значения стандартной концентрации исходного раствора. Убедитесь, что весь аналит перенесен в колбу; при необходимости используйте немного растворителя, чтобы промыть его.
Сделайте серию различных разбавлений исходного стандарта, перенеся известные объемы исходного стандарта в мерные колбы, используя пипетки для точного переноса, а затем добавив растворитель. Самая низкая стандартная концентрация должна быть ниже самой низкой предполагаемой пробы для анализа. В примере с безалкогольным напитком, если наименьшая ожидаемая концентрация фруктозы в образце составляет 2 грамма / 100 мл, тогда может быть получен стандарт 1 грамм / 100 мл. Это можно сделать путем десятикратного разбавления стандартного запаса. Стандартная серия должна включать в общей сложности 5 или 6 концентраций, поэтому потребуются дополнительные разведения для получения стандартов, составляющих, возможно, 3, 5 и 8 граммов фруктозы / мл. Теперь у вас есть ряд стандартных растворов для калибровки ВЭЖХ.