Chimiștii folosesc cromatografie lichidă de înaltă performanță sau HPLC, pentru a separa amestecurile de compuși. În general, metoda constă în injectarea unei probe într-o coloană în care se amestecă cu unul sau mai mulți solvenți. Compuși diferiți se adsorb sau coloană la coloană la diferite grade; iar pe măsură ce solventul împinge compușii prin coloană, unul dintre componentele amestecului va ieși mai întâi din coloană. Instrumentul detectează compușii la ieșirea din coloană și produce o cromatogramă care constă dintr-un grafic cu timp de reținere pe axa x și intensitatea semnalului de la detectorul pe axa y. Pe măsură ce compușii ies din coloană, produc „vârfuri” în cromatogramă. În general, cu cât sunt mai îndepărtate și cu cât vârfurile din cromatogramă sunt mai înguste, cu atât rezoluția este mai mare. Oamenii de știință consideră că o rezoluție de 1,0 sau mai mare reprezintă o separare adecvată.
Măsurați lățimile a două vârfuri adiacente din cromatogramă notând unde se află valorile axei x la baza fiecărui vârf. Axa x reprezintă timpul de retenție, de obicei măsurat în secunde. Astfel, dacă un vârf începe la 15,1 secunde și se termină la 18,5 secunde, lățimea sa este (18,5 - 15,1) = 3,4 secunde.
Determinați timpii de reținere notând timpul, adică locația pe axa x, care corespunde locațiilor maximei vârfurilor. Această valoare va fi în mod normal aproximativ la jumătatea distanței dintre cele două valori utilizate pentru a calcula lățimea la pasul 1. Exemplul dat în pasul 1, de exemplu, ar prezenta un maxim la aproximativ 16,8 secunde.
Calculați rezoluția, R, între două vârfuri prin:
R = \ frac {RT_1-RT_2} {0,5 (W_1 + W_2)}
unde RT1 și RT2 reprezintă timpii de reținere a vârfurilor 1 și 2 și W1 și W2 reprezintă lățimile vârfurilor luate la bazele lor. Continuând exemplul de la pașii 2 și 3, un vârf prezintă un timp de retenție de 16,8 secunde și o lățime de 3,4 secunde. Dacă al doilea vârf ar prezenta un timp de reținere de 21,4 secunde cu o lățime de 3,6 secunde, atunci rezoluția ar fi:
R = \ frac {21.4-16.8} {0.5 (3.4 + 3.6)} = 1.3
Lucruri de care ai nevoie
- Cromatograma HPLC
- Calculator