Membranele celulare constau din fosfolipide și proteine atașate sau încorporate. Proteinele de membrană joacă roluri vitale în metabolismul și viața celulei. Nu puteți utiliza microscopia obișnuită pentru a vizualiza sau caracteriza proteinele de adeziune, transporta proteinele și canalele proteice în membrana celulară. Folosind microscopia electronică și o tehnică numită "fractură de îngheț", care împarte membranele celulare înghețate, permite vizualizarea structurii membranei și organizarea proteinelor în marea de fosfolipide. Combinarea altor metode cu fractura prin congelare nu numai că ne ajută să înțelegem structura diferitelor membrane celulare și proteine de membrană, dar permite vizualizarea și analiza detaliată a funcției proteinelor specifice, bacteriilor și viruși.
Pași de bază în înghețarea fracturii
Folosind azot lichid, probele de țesut biologic sau celulele sunt înghețate rapid pentru a imobiliza constituenții celulelor. Membranele celulare sunt compuse din două straturi de fosfolipide, numite bistrat, unde cozile lipidice hidrofobe sau care urăsc apa interiorul membranei și capetele hidrofile sau iubitoare de apă ale moleculei lipidice îndreaptă spre exterior și spre interiorul celulă. Proba înghețată este crăpată sau fracturată cu un microtom, care este un instrument asemănător cuțitului pentru tăierea feliilor subțiri de țesut. Acest lucru face ca membrana celulară să se despartă precis între cele două straturi, deoarece atracția dintre cozile lipidice hidrofobe reprezintă cel mai slab punct. După fracturare, eșantionul este supus unei proceduri de vid, numită „gravare prin îngheț”. Suprafața fracturată proba este umbrită cu vapori de carbon și platină pentru a face o replică stabilă, care urmează contururile fracturii avion. Acidul este utilizat pentru a digera materialul organic care aderă la replică, lăsând o coajă subțire de platină a suprafeței membranei fracturate. Această coajă este apoi analizată prin microscopie electronică.
Înghețați gravura
Gravarea prin congelare este uscarea sub vid a unei probe biologice nefixate, congelate și fracturate prin congelare. Procedura de uscare sub vid este similară cu congelarea fructelor și legumelor care sunt ambalate și vândute la magazinele alimentare. Fără gravarea prin îngheț, multe detalii ale structurii celulare sunt ascunse de cristalele de gheață. Etapa de gravare profundă sau de înghețare îmbunătățește și extinde metoda originală de fracturare prin înghețare, permițând observarea membranelor celulare în timpul diferitelor activități. Permite analiza nu numai a structurii membranei, ci și a componentelor intracelulare și oferă informații structurale detaliate despre bacterii, viruși și proteine celulare mari complexe.
Microscopie electronică
Microscopia electronică poate dezvălui și mări de peste un milion de ori cele mai mici organisme sau structuri, cum ar fi bacteriile, virușii, componentele intracelulare și chiar proteinele. Vizualizarea este creată prin bombardarea unei probe ultra-subțiri cu un fascicul de electroni. Cele două metode de microscopie electronică sunt microscopia electronică de scanare sau SEM și microscopia electronică de transmisie sau TEM. Probele de fractură prin îngheț sunt analizate în mod obișnuit cu TEM. TEM are o rezoluție mai bună decât SEM și oferă informații structurale până la 3 nanometri de replici.
Structura membranei celulare revelatoare
Dezvoltarea și utilizarea microscopiei electronice prin fractură prin îngheț au arătat că membranele plasmatice ale celulei sunt formate din straturi lipidice și a clarificat modul în care proteinele sunt organizate în membranele celulare. Fractura prin înghețare oferă un aspect unic asupra interiorului membranelor celulare, deoarece împarte și separă fosfolipidele membranei în două foi sau fețe opuse și complementare. În cei peste 50 de ani de la introducerea primei mașini de fracturare prin îngheț, realizarea unei replici de platină este în continuare singura modalitate de a obține informații structurale despre membrana celulară. Tehnica arată dacă anumite proteine plutesc sau sunt ancorate în membrana celulară și dacă și cum se agregă unele proteine. O metodă mai nouă - folosind anticorpi care vizează proteine specifice - este combinată cu fractura de congelare pentru a identifica proteinele și funcția lor în membrana celulară.