Secvențierea ADN: definiție, metode, exemple

Nucleotidele sunt elementele chimice ale vieții și se găsesc în ADN-ul organismelor vii. Fiecare nucleotidă constă din un zahăr, fosfat și a bază care conține azot: adenină (A), timină (T), citozină (C) și guanină (G). Ordinea specifică a acestor baze nucleotidice determină ce proteine, enzime și molecule vor fi sintetizate de celulă.

Determinarea ordinii sau secvenței nucleotidelor este importantă pentru studiul mutații, evoluția, progresia bolii, testarea genetică, investigația criminalistică și medicina.

Genomică este studiul ADN-ului, genelor, interacțiunilor genice și influențelor de mediu asupra genelor. Secretul dezvăluirii funcționării interioare complexe a genelor este acela de a putea identifica structura și locația lor pe cromozomi.

Planul organismelor vii este determinat de ordinea (sau secvența) perechilor de baze de acid nucleic din ADN. Când ADN-ul se replică, adenina se împerechează cu timina și citozina cu guanina; sunt considerate perechi nepotrivite mutații.

Din moment ce helica dublă acidul dezoxiribonucleic Molecula (ADN) a fost conceptualizată în 1953, s-au făcut îmbunătățiri dramatice în domeniul genomicii și al secvențierii ADN-ului la scară largă. Oamenii de știință lucrează cu sârguință pentru a aplica aceste noi cunoștințe tratamentului individualizat al bolilor.

În același timp, discuțiile în curs permit cercetătorilor să rămână în fața implicațiilor etice ale unor astfel de tehnologii care explodează rapid.

Secvențierea ADN este procesul de descoperire a secvenței diferitelor baze nucleotidice în fragmente de ADN. Secvențierea întregii gene permite compararea cromozomilor și a genomilor prezenți în aceeași specie și în diferite specii.

Cartografierea cromozomilor este utilă pentru cercetarea științifică. Analizând mecanismele și structura gene, alelele și mutațiile cromozomiale din moleculele ADN sugerează noi modalități de a trata tulburările genetice și de a opri creșterea tumorilor canceroase, de exemplu.

Metodele de secvențiere a ADN ale lui Frederick Sanger a avansat foarte mult domeniul genomicii începând din anii '70. Sanger s-a simțit gata să abordeze secvențierea ADN după ce a secvențiat cu succes ARN atunci când studia insulina. Sanger nu a fost primul om de știință care s-a implicat în secvențierea ADN-ului. Cu toate acestea, metodele sale inteligente de secvențiere a ADN-ului - dezvoltate în tandem cu colegii Berg și Gilbert - au obținut un premiu Nobel în 1980.

Sanger știa valoarea potențială a muncii sale și a colaborat adesea cu alți oameni de știință care împărtășeau interesele sale pentru ADN, biologie moleculara și știința vieții.

Deși lent și costisitor în comparație cu tehnologiile de secvențiere actuale, metodele de secvențiere a ADN-ului lui Sanger au fost apreciate la acea vreme. După încercări și erori, Sanger a găsit „rețeta” secretă biochimică de separare a firelor de ADN, creând mai mult ADN și identificând ordinea nucleotidelor dintr-un genom.

Materialele de înaltă calitate pot fi achiziționate cu ușurință pentru a fi utilizate în studii de laborator:

• ADN polimerază este enzima necesară pentru a produce ADN-ul.
• Primer de ADN spune enzimei de unde să înceapă să lucreze la catena ADN.
• dNTP-uri sunt molecule organice formate din zahăr dezoxiriboză și trifosfați nucleozidici - dATP, dGTP, dCTP și dTTP - care asamblează proteine
• Terminale de lanț sunt nucleotide colorante, numite și nucleotide terminatoare pentru fiecare bază - A, T, C și G.

Sanger a aflat cum să taie ADN-ul în segmente mici folosind enzima ADN polimerază.

Apoi a realizat mai mult ADN dintr-un șablon și a inserat urmăritori radioactivi în noul ADN pentru a delimita secțiuni ale firelor separate. El a recunoscut, de asemenea, că enzima are nevoie de un primer care să se poată lega de un punct specific de pe șuvița șablon. În 1981, Sanger a făcut din nou istorie descoperind genomul celor 16.000 de perechi de baze ale ADN-ului mitocondrial.

Temperatura trebuie ajustată cu atenție pe tot parcursul procesului de secvențiere. În primul rând, substanțele chimice sunt adăugate într-un tub și încălzite pentru a dezlega (denaturarea) dublu-catenar Molecula ADN. Apoi temperatura este răcită, permițând grundul să se lipească.

Apoi, temperatura este crescută pentru a încuraja activitatea optimă ADN polimerază (enzimă).

Polimeraza folosește de obicei nucleotidele normale disponibile, care sunt adăugate la o concentrație mai mare. Când polimeraza ajunge la o nucleotidă legată de colorant „terminând lanțul”, polimeraza se oprește și lanțul se termină acolo, ceea ce explică de ce nucleotidele vopsite sunt numite „terminare a lanțului” sau „Terminatori”.

Procesul continuă de foarte multe ori. În cele din urmă, nucleotida legată de colorant a fost plasată la fiecare poziție a secvenței ADN. Electroforeza pe gel și programele de computer pot identifica apoi culorile vopselei pe fiecare dintre firele de ADN și calculează întreaga secvență de ADN pe baza colorantului, poziția colorantului și lungimea acestuia suvite.

Secvențierea de mare viteză - denumit în general secvențierea generației următoare - folosește noi progrese și tehnologii pentru a secvența bazele nucleotidice mai rapid și mai ieftin decât oricând. O mașină de secvențiat ADN poate manipula cu ușurință întinderi de ADN la scară largă. De fapt, întregul genom poate fi realizat în câteva ore, în loc de ani, cu tehnicile de secvențiere ale lui Sanger.

Metodele de secvențiere de generația următoare pot gestiona analiza ADN-ului cu volum mare, fără etapa adăugată de amplificare sau clonare, pentru a obține suficient ADN pentru secvențiere. Mașinile de secvențiat ADN rulează mai multe reacții de secvențiere simultan, ceea ce este mai ieftin și mai rapid.

În esență, noua tehnologie de secvențiere a ADN rulează sute de reacții Sanger pe un microcip mic, ușor de citit, care este apoi rulat printr-un program de computer care asamblează secvența.

Tehnica citește fragmente de ADN mai scurte, dar este încă mai rapidă și mai eficientă decât metodele de secvențiere ale lui Sanger, astfel încât chiar și proiectele la scară largă pot fi finalizate rapid.

Proiectul genomului uman, finalizat în 2003, este unul dintre cele mai faimoase studii de secvențiere realizate până în prezent. Potrivit unui articol din 2018 în Știri științifice, genomul uman este format din aproximativ 46.831 gene, ceea ce a reprezentat o provocare formidabilă de succesiune. Oamenii de știință de top din întreaga lume au petrecut aproape 10 ani colaborând și consultând. Condusă de cercetarea națională a genomului uman

Institute, proiectul a cartografiat cu succes genomul uman folosind un eșantion compozit prelevat de la donatori de sânge anonimi.

Proiectul genomului uman s-a bazat pe metode de secvențiere a cromozomului artificial bacterian (bazat pe BAC) pentru cartografierea perechilor de baze. Tehnica a folosit bacterii pentru a clona fragmente de ADN, rezultând în cantități mari de ADN pentru secvențiere. Clonele au fost apoi reduse în dimensiune, plasate într-o mașină de secvențiat și asamblate în întinderi reprezentând ADN uman.

Noile descoperiri în genomică schimbă profund abordările în prevenirea, detectarea și tratamentul bolilor. Guvernul a alocat miliarde de dolari pentru cercetarea ADN-ului. Oamenii legii se bazează pe analiza ADN pentru rezolvarea cazurilor. Kituri de testare ADN pot fi achiziționate pentru uz casnic pentru a cerceta strămoșii și pentru a identifica variantele genetice care pot prezenta riscuri pentru sănătate:

• Analiza genomică presupune compararea și contrastarea secvențelor genomice ale multor specii diferite din domeniile și regatele vieții. Secvențierea ADN-ului poate dezvălui modele genetice care aruncă o nouă lumină atunci când anumite secvențe au fost introduse evolutiv. Ascendența și migrația pot fi urmărite prin analiza ADN și comparate cu înregistrările istorice.

• Progrese în medicină se întâmplă într-un ritm exponențial, deoarece practic fiecare boală umană are o componentă genetică. Secvențierea ADN ajută oamenii de știință și medicii să înțeleagă modul în care mai multe gene interacționează între ele și cu mediul. Secvențierea rapidă a ADN-ului unui nou microb care provoacă un focar de boală poate ajuta la identificarea medicamentelor și vaccinurilor eficiente înainte ca problema să devină o problemă gravă de sănătate publică. Variantele genetice din celulele canceroase și tumorile ar putea fi secvențiate și utilizate pentru a dezvolta terapii genice individualizate.

• Criminalistica cererile au fost folosite pentru a ajuta forțele de ordine să spargă mii de cazuri dificile de la sfârșitul anilor 1980, potrivit Institutul Național al Justiției. Dovezile de la locul crimei pot conține probe de ADN din os, păr sau țesut corporal care pot fi comparate cu profilul ADN al unui suspect pentru a ajuta la determinarea vinovăției sau a inocenței. Reacția în lanț a polimerazei (PCR) este o metodă utilizată în mod obișnuit pentru a face copii ale ADN-ului din urmele probelor înainte de secvențiere.

• Secvențierea speciilor nou descoperite poate ajuta la identificarea altor specii care sunt cele mai strâns legate și dezvăluie informații despre evoluție. Taxonomiștii folosesc „coduri de bare” ADN pentru a clasifica organismele. In conformitate cu Universitatea din Georgia în mai 2018, există aproximativ 303 de specii de mamifere încă de descoperit.

• Testarea genetică a bolilor căutați variante genetice mutante. Majoritatea sunt polimorfisme cu un singur nucleotid (SNPs), ceea ce înseamnă că doar un nucleotid din secvență este schimbat din versiunea „normală”. Factorii de mediu și stilul de viață afectează modul în care și dacă anumite gene sunt exprimate. Companiile globale pun la dispoziție cercetătorilor din întreaga lume tehnologii de ultimă generație de secvențiere, disponibile pentru cercetătorii din întreaga lume, interesați de interacțiunile multigene și secvențierea genomului întreg.

• Kituri ADN genealogice utilizați secvențe de ADN în baza lor de date pentru a verifica variante în genele unui individ. Trusa necesită o probă de salivă sau un tampon de obraz care este trimis prin poștă la un laborator comercial pentru analiză. În plus față de informațiile despre strămoși, unele truse pot identifica polimorfisme cu nucleotide unice (SNP) sau altele variante genetice binecunoscute precum genele BRCA1 și BRCA2 asociate cu risc crescut pentru sânul feminin și cancer ovarian.

Noile tehnologii vin adesea cu posibilitatea de a beneficia de beneficii sociale, precum și de a face rău; exemple includ centrale nucleare care nu funcționează defectuos și arme nucleare de distrugere în masă. Tehnologiile ADN vin și cu riscuri.

Preocupările emoționale cu privire la secvențierea ADN și instrumentele de editare a genelor precum CRISPR includ temeri că tehnologia ar putea facilita clonarea umană sau poate duce la animale transgenice mutante create de un necinstit om de stiinta.

Mai des, problemele etice legate de secvențierea ADN au legătură cu consimțământul informat. Accesul ușor la testarea ADN direct către consumator înseamnă că este posibil ca consumatorii să nu înțeleagă pe deplin modul în care informațiile lor genetice vor fi utilizate, stocate și partajate. Este posibil ca laicii să nu fie gata din punct de vedere emoțional să învețe despre variantele lor genetice defecte și riscurile asupra sănătății.

Terțe părți, cum ar fi angajatorii și companiile de asigurări, ar putea discrimina persoanele care au gene defecte, care pot da naștere unor probleme medicale grave.