Potrivit site-ului web BioWeb al Universității din Wisconsin, un primer PCR este o oligonucleotidă sintetică scurtă (de obicei între 18 până la 25 de baze) utilizate pentru a amplifica regiuni specifice ale ADN-ului într-o tehnică de biologie moleculară cunoscută sub numele de reacție în lanț a polimerazei (PCR). Sunt necesare atât un primer direct, cât și un revers, concepute pentru a fi complementare reversibile ale catenei de ADN, pentru a flanca și a se lega de regiunea de ADN dorită. Când oamenii de știință doresc să efectueze cercetări cu privire la o anumită genă sau regiune a ADN-ului, trebuie mai întâi să efectueze PCR pentru a dobândi suficient din regiunea țintă cu care să lucreze. Proiectarea secvențelor de grund pentru regiunea de interes poate fi necesară dacă nu sunt deja disponibile prin cercetări publicate anterior sau prin mijloace comerciale.
Obțineți secvența de nucleotide a genei sau a regiunii ADN de interes și decideți cât timp doriți să amplificați un fragment. Grundul înainte și invers este proiectat pentru a se lega la începutul și la sfârșitul fragmentului dorit. De obicei, metodele convenționale de PCR utilizează grunduri care flancează o regiune între 100 și 1.000 de perechi de baze, în timp ce metodele PCR în timp real utilizează fragmente de aproximativ 50 până la 200 de perechi de baze.
Decideți unde doriți să se întindă grundurile în secvență. De exemplu, s-ar putea să doriți locația în apropierea capătului 5 'sau 3' al secvenței sau în mijloc. Dacă se dorește, desemnați locația primerilor pentru a acoperi un intron.
Proiectați grundele cu lungimea de 18 până la 24 de baze. Vincent R. Prezioso, Ph. D., de la Brinkmann Instruments Inc., sugerează că această lungime este suficient de lungă pentru a fi extrem de specifică regiunii de ADN dorite, dar suficient de scurtă pentru a se lega (a se recoace) cu ușurință. Temperatura primară de topire (Tm) trebuie să fie între 55 și 80 de grade Celsius, suficient de scăzută pentru a permite topirea completă la sau peste 90 de grade Celsius, dar suficient de ridicată pentru a permite recoacerea. Conținutul GC (procentul de Gs și Cs în secvență) ar trebui să fie între 40 și 60%. Capătul 3 'al secvenței de grund ar trebui să se termine într-un C sau un G (numit clemă GC) pentru a promova legarea, deoarece G și C nucleotidele au legături mai puternice, cu toate acestea, evitați să aveți trei sau mai multe Gs sau Cs în ultimele cinci baze ale secvenței.
Evitați să aveți curse de patru sau mai multe dintr-o bază (cum ar fi ACCCC ...) sau patru sau mai multe repetări di-nucleotidice (cum ar fi ATATATAT ...), deoarece acestea pot provoca greșeală. Proiectați primerii fără omologie intra-primer (mai mult de trei baze care se completează în cadrul unuia primer în sine) sau omologie inter-primer (unde primerul invers și primerul au complementare secvențe). Acest lucru poate provoca auto-dimeri sau primer-dimeri, unde primerii se leagă de ei înșiși în loc să se lege de secvența de ADN dorită.
Utilizați resurse online și site-uri web care vă ajută la proiectarea grundului sau vă ajută să verificați secvențele de grund pentru auto-complementaritate sau potențialul de a crea structuri secundare, cum ar fi ace de păr. Unele site-uri web de design de grund includ Primer3 al Institutului de Tehnologie din Massachusetts, Primer-Blast al Centrului Național pentru Informații despre Biotehnologie și OligoAnalyzer al Tehnologiilor ADN integrate.