Western blot este una dintre cele mai frecvente proceduri în laboratoarele biochimice. Practic, separă proteinele dintr-o probă în funcție de dimensiune, apoi testează folosind anticorpi pentru a determina dacă este prezentă o anumită proteină. Este util nu numai în cercetare, ci și în laboratoare medicale sau de diagnostic; testele atât pentru HIV cât și pentru boala Lyme, de exemplu, implică un test de test imunosorbent legat de enzime (ELISA), urmat de un Western blot dacă testul ELISA este pozitiv. În ciuda popularității sale, totuși, Western blot are mai multe dezavantaje.
Necantitativ
Western blots clasice sunt necantitative. Cu alte cuvinte, deși pot spune cercetătorilor dacă este prezentă o anumită proteină, nu fac posibilă cuantificarea cantității din proteine. Unele companii de biotehnologie vând acum kituri care permit cercetătorilor sau tehnicienilor de laborator să cuantifice cantitatea de proteine prezente folosind o curbă standard - dar acest lucru funcționează numai dacă sunt probe pure din aceeași proteină disponibil. Mai mult decât atât, greutatea moleculară a unei proteine poate fi estimată numai cu Western blot, mai degrabă decât determinată exact ca la spectrometria de masă.
Anticorpi
O Western blot poate fi efectuată numai dacă sunt disponibili anticorpi primari împotriva proteinei de interes. În timp ce anticorpii pentru multe proteine diferite sunt disponibili de la companiile de biotehnologie, nu sunt ieftini; dacă anticorpii primari nu sunt disponibili pentru o anumită proteină, nu va fi posibilă efectuarea unei Western blot în căutarea proteinei respective. Mai mult, cercetătorii ar putea dori să stabilească dacă o proteină a fost modificată într-un fel - dacă a fost fosforilată (a avut o grupul fosfat atașat la acesta), de exemplu - și cu tehnica Western blot au nevoie de anticorpi specifici celor modificați proteină.
Instruire
Poate fi o provocare să efectuați corect Western blot și să obțineți rezultate bune, astfel încât personalul trebuie să fie bine instruit. În acest sens, ca în multe altele, experiența este poate cel mai bun tutor; chiar și pentru un tehnician cu experiență, totuși, Western blot consumă mult timp. Porțiunea de electroforeză pe gel a experimentului, de exemplu, va dura de obicei de la una la două ore pentru a rula. Alte sarcini pot fi îndeplinite în timp ce gelul rulează, desigur, dar experimentul durează destul de mult timp pentru a obține rezultate.
Alte limitări
Anticorpii pot prezenta uneori unele legături în afara țintei, ceea ce poate duce la rezultate mai slabe. Mai mult, cu Western blot, utilizați un anticorp împotriva unei proteine specifice, astfel încât rezultatele dvs. vă vor spune doar dacă proteina respectivă a fost prezentă. În schimb, spectrometria de masă cu rezoluție înaltă dezvăluie toate proteinele prezente într-o probă și, spre deosebire de Western Blot, este cantitativă. Este important să ne amintim, desigur, că spectrometria de masă este mult mai scumpă și, de asemenea, mai dificilă din punct de vedere tehnic de utilizat în comparație cu Western blot.