Când lucrați cu cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC), o calibrare bună este absolut esențială pentru a asigura rezultate fiabile și de calitate. Calibrarea corectă a unui instrument HPLC începe cu realizarea unui standard de calibrare adecvat. În majoritatea cazurilor, calibrarea necesită de fapt o serie de standarde de creștere a concentrației pentru a produce ceea ce este cunoscut sub numele de curbă de calibrare. Aceasta este o linie reprezentată și ecuația asociată care descrie relația dintre concentrația substanței chimice testate și răspunsul detectorului HPLC.
Determinați substanța chimică pe care doriți să o testați pentru utilizarea HPLC („analitul”). De exemplu, ați putea dori să testați o serie de băuturi răcoritoare pentru conținutul de fructoză, caz în care fructoza ar fi analitul.
Se obține o cantitate de substanță chimică analitică de puritate adecvată. În mod normal, puritatea ar trebui să fie peste 99%, iar analitul ar trebui să fie achiziționat de la o companie de renume chimică. De exemplu, în cazul fructozei, ați cumpăra fructoză pură de la un furnizor de produse chimice și nu de la un magazin alimentar.
Determinați concentrațiile maxime și minime anticipate ale analitului în probele pe care intenționați să le testați pe HPLC. În cazul băuturilor răcoritoare, ar trebui să examinați etichetele băuturilor și să determinați cel mai mic și cel mai mare conținut de fructoză dintre băuturile pe care le veți testa. Rețineți că proba inițială (băutura răcoritoare) poate fi diluată sau manipulată în alt mod în timpul pregătirii pentru analiză (în funcție de metoda HPLC utilizată) și astfel poate fi concentrația de analit în probele injectate efectiv pe HPLC modificat. Trebuie luată în considerare concentrația analitului din probe, efectuată pe HPLC.
Determinați solventul în care veți dizolva analitul pentru a compune standardele de calibrare. Acest solvent trebuie să fie capabil să dizolve în mod corespunzător analitul pe o gamă relativ largă de concentrație (cel puțin la fel de mare ca în probele pe care intenționați să le testați). De asemenea, acest solvent ar trebui să fie în mod ideal similar cu "faza mobilă": solventul utilizat pentru transportarea probelor prin instrumentul HPLC.
Calculați cantitatea de analit necesară pentru a face o soluție „standard de stoc” a analitului. Acest lucru se găsește înmulțind concentrația necesară a standardului stocului cu volumul dorit. Concentrația analitului din această soluție ar trebui să fie cu cel puțin 10% mai mare decât cea mai mare concentrație anticipată a probei. Dacă cea mai mare concentrație de fructoză anticipată într-o probă de băuturi răcoritoare este de 8 grame / 100 mililitri, atunci standardul de stoc ar putea fi făcut la o concentrație de 10 grame fructoză / 100 mililitri. Un volum rezonabil este de 500 de mililitri, deci ar fi necesare 8/100 ml x 500 ml = 40 grame fructoză.
Se cântărește cantitatea necesară de analit la un nivel adecvat de precizie. Adesea este potrivită o valoare a greutății în grame, precisă cu una sau două zecimale, dar poate fi necesară o mai mare precizie pentru unele metode.
Transferați analitul cântărit într-un balon volumetric cu volumul necesar și adăugați solventul dorit la semnul de umplere de pe balon. Utilizarea unui balon volumetric (mai degrabă decât a unui pahar gradat, de exemplu) crește precizia valorii concentrației standard a stocului. Asigurați-vă că tot analitul este transferat în balon; folosiți o parte din solvent pentru a-l spăla, dacă este necesar.
Efectuați o serie de diluții variabile ale standardului stoc transferând volume cunoscute ale standardului stoc în baloane volumetrice, folosind pipete pentru transfer precis, apoi adăugând solvent. Cea mai mică concentrație standard ar trebui să fie sub cea mai mică probă anticipată care urmează să fie analizată. În exemplul băuturilor răcoritoare, dacă cea mai scăzută concentrație de fructoză așteptată într-o probă este de 2 grame / 100 ml, atunci ar putea fi realizat un standard de 1 gram / 100 ml. Acest lucru ar fi realizat printr-o diluare de zece ori a standardului de stoc. Seria standard ar trebui să includă un total de 5 sau 6 concentrații, astfel încât ar fi necesare diluții suplimentare pentru a produce standarde de probabil 3, 5 și 8 grame fructoză / ml. Aveți acum o serie de soluții standard cu care puteți calibra HPLC.