Electroforeza pe gel de dodecil sulfat de sodiu-poliacrilamidă (SDS-PAGE) este o metodă biochimică de identificare a proteinelor în soluție. Așa cum este ilustrat de Mathews și colab în „Biochimie”, probele de proteine sunt încărcate mai întâi în „godeuri” sau găuri pe un capăt al blocului de gel de poliacrilamidă. Un câmp electric este apoi aplicat pe gel. SDS, adăugat la probele încărcate, neagă sarcina naturală a proteinelor. Din acest motiv, greutatea moleculară a proteinelor determină singură viteza de migrare a proteinelor pe măsură ce se deplasează prin gel către polul încărcat pozitiv, notează Bitesize Bio. Prin urmare, mai multe proteine din același eșantion se vor separa unele de altele și vor migra în poziții diferite.
Orientează fotografia cu gel. „Sus” este locația puțurilor în care au fost adăugate inițial probele. „Partea de jos” este locul în care eșantioanele au migrat și conțin cel mai adesea fața de colorant care indică fața de migrare a eșantioanelor. Fie stânga, fie dreapta ar trebui să conțină un „marker”, folosit ca ghid de greutate moleculară previzibil.
Etichetați mostrele pentru fiecare bandă. În partea de sus, probele adăugate la fântâni vor fi migrat vertical pe „benzi”. Prin urmare, toate barele vizibile într-o coloană verticală provin din un eșantion încărcat direct deasupra acestuia. Utilizați rigla și stiloul pentru a pune margini pe benzi dacă este dificil să vizualizați coloanele.
Etichetați dimensiunile moleculare ale benzilor din banda de marcare. Markerii disponibili comercial vin cu o imagine a modelului de bandă de așteptat, împreună cu greutățile moleculare ale fiecărei benzi. Benzile sunt „bare” orizontale întunecate, care sunt de fapt proteine colorate încorporate în gel.
Desenați linii orizontale ușoare care se extind de la fiecare bandă de marker la marginea opusă a gelului. Aveți grijă să faceți aceste linii paralele cu fântânile și cu partea din față a vopselei. Aceste linii indică locul în care proteinele cu greutatea moleculară indicate de fiecare dintre benzile marker ar fi situate în fiecare bandă. De exemplu, o bandă din banda 4 care se află chiar sub linia extinsă de la 25-kilodalton banda marker ar sugera că banda 4 a benzii are aproape, dar nu chiar 25 kilodaltoni în moleculă greutate.
Etichetați fiecare bandă din fiecare bandă cu greutatea moleculară estimată. Utilizați markerii ca ghid și evaluați valorile între dimensiunile markerului.
Sub fotografia cu gel, faceți o listă cu „proteine” pentru fiecare bandă. Începeți prin a indica ceea ce se știe despre fiecare eșantion, cum ar fi originea sau condițiile sale. Apoi enumerați greutatea moleculară estimată a fiecărei benzi din bandă. Benzile cu o bandă indică faptul că proba conține o singură proteină. Benzile cu benzi multiple indică prezența mai multor proteine. Benzile care rulează cu frontul de migrare sunt mai mici decât cele sugerate de cel mai apropiat marker și probabil nu pot fi prezise decât cu „mai mici decât” indicat de marker.
În lista proteinelor, notați ciudățenii. Un aspect „pătat” poate indica faptul că sunt prezente prea multe proteine sau că vâscozitatea eșantionului a afectat migrarea acestuia Dacă benzile par să depășească marginea benzii sau sunt destul de mari în comparație cu alte benzi, atunci concentrația proteinei respective este probabil prea mare și ar trebui diluată în viitor electroforeză. O nuanță cenușie pe toată banda, mai închisă decât culoarea gelului de fundal, indică fragmente de proteine care nu se disting.
Determinați identitatea proteinelor din fiecare bandă. Deși acest lucru se face folosind doar greutatea moleculară, sursa fiecărei benzi va indica probabil și indicii. Luați în considerare faptul că, în anumite condiții, proteinele pot menține o asociere de dimeri sau trimeri pe un gel. Prin urmare, o proteină poate apărea pe un gel ca trei benzi distincte. Chiar dacă proteinele nu pot fi identificate, întunericul relativ al benzilor poate implica concentrațiile proteinelor în soluție. Orice proteine curioase și necunoscute pot fi izolate direct din gelul original și trimise pentru identificare.
Lucruri de care ai nevoie
- Fotografie a gelului SDS-PAGE, colorat
- Cheia pentru markerul de greutate moleculară utilizat
- Rigla
- Pix