Elektroforeza żelowa to technika, w której cząsteczki biologiczne są oddzielane od siebie i identyfikowane w badaniach biologicznych lub diagnostyce medycznej. Od czasu ich opracowania w latach 70. techniki te były nieocenione w identyfikacji genów (DNA) i produktów genów (RNA i białka) będących przedmiotem zainteresowania badawczego. W ostatnich latach pojawiły się nowsze techniki, które dają większą szczegółowość i szczegółowość tego, co dzieje się w żywych systemach. Chociaż nie wyparły one technik elektroforezy, a zaawansowane manipulacje mogą zwiększyć żywotność techniki, ważne jest, aby zdać sobie sprawę, co może, a czego nie może zrobić elektroforeza żelowa.
Elektroforeza ma ograniczoną analizę próbek
Elektroforeza jest specyficzna dla każdej tkanki, którą pobrałeś. Na przykład, jeśli przeprowadzisz Southern blot (rodzaj elektroforezy) na wymazu z policzka, patrzysz na geny z komórek nabłonkowych twojego policzka i nigdzie indziej w twoim ciele. Czasami może to być korzystne, ale badacze często są zainteresowani bardziej rozpowszechnionymi skutkami.
Techniki takie jak hybrydyzacja in situ (ISH) mogą pobierać skrawki tkanki i analizować ekspresję genów na każdym małym obszarze tej próbki. W ten sposób naukowcy mogą przyjrzeć się każdemu obszarowi mózgu w próbce za pomocą ISH, podczas gdy techniki elektroforezy mogą przyglądać się tylko kilku obszarom na raz.
Pomiary elektroforezy nie są precyzyjne
Elektroforeza żelowa może skutecznie oddzielić podobne białka o różnej masie (jest to technika zwana Western blot). Może je dokładniej rozdzielić za pomocą techniki znanej jako elektroforeza 2d; jest to powszechne w proteomice.
Niestety, wszystkie pomiary wykonane tą techniką są w najlepszym razie półilościowe. W celu uzyskania dokładnej masy (wagi) białek należy zastosować spektroskopię mas po oczyszczeniu białka metodą elektroforezy. Ponadto porównywanie względnych ilości różnych cząsteczek opiera się na gęstości prążków (ciemności) różnych plam na żelu. Ta metoda ma pewien stopień błędu, a próbki są zwykle uruchamiane wiele razy, aby uzyskać czyste wyniki.
Wymagana jest znaczna próbka początkowa
Elektroforeza to technika izolacji i wizualnej identyfikacji różnych biomolekuł. Odbywa się to poprzez przepuszczanie prądu elektrycznego przez żel w celu oddzielenia naładowanych cząsteczek o różnej masie. Jeśli interesująca Cię cząsteczka nie jest wystarczająco powszechna, jej pasmo będzie praktycznie niewidoczne i trudne do zmierzenia.
DNA i RNA można nieco zamplifikować przed przeprowadzeniem elektroforezy, ale nie jest to praktyczne w przypadku białek. Dlatego do przeprowadzenia tych testów potrzebna jest duża próbka tkanki. Może to ograniczyć użyteczność techniki, zwłaszcza w analizie medycznej. Przeprowadzenie elektroforezy na próbkach z pojedynczej komórki jest praktycznie niemożliwe; Do oceny ekspresji białek komórka po komórce częściej stosuje się cytometrię przepływową i immunohistochemię. Technika zwana PCR doskonale nadaje się do precyzyjnego pomiaru niewielkich ilości RNA.
Tylko niektóre cząsteczki mogą być wizualizowane
Elektroforeza doskonale nadaje się do oddzielania i identyfikacji biocząsteczek o średnich i dużych rozmiarach. Jednak wiele cząsteczek, którym naukowcy chcą się przyjrzeć, jest mniejszych; małych hormonów, neuroprzekaźników i jonów nie można zmierzyć za pomocą elektroforezy. Dzieje się tak z dwóch powodów: nie reagują prawidłowo z preparatem do elektroforezy (zwykle technika) SDS PAGE), a nawet gdyby tak było, są zbyt małe, aby można je było właściwie rozdzielić, i pospieszyłyby z dna żel. Cząsteczki te są zamiast tego mierzone za pomocą technik, takich jak RIAA (testy radioimmunologiczne) i ELISA (test immunoenzymatyczny).
Elektroforeza to niska przepustowość
Elektroforeza żelowa jest ogólnie mało wydajna, co oznacza, że nie generuje danych szczególnie szybko. Elektroforeza kontrastowa, w której można jednocześnie oglądać niewielką garść cząsteczek RNA, z PCR (reakcją łańcuchową polimerazy), która może jednocześnie oceniać tysiące próbek. Podobnie cytometria przepływowa może wykonywać pomiary z tysięcy pojedynczych komórek i komplikować korelacje, podczas gdy elektroforeza patrzy na komórki masowo i nie może zrobić tak dobrze such dyskryminacje. PCR i cytometria przepływowa reprezentują odpowiednio procesy równoległe i seryjne, które znacznie przewyższają możliwości elektroforezy w zakresie generowania danych badawczych.