Jeśli chodzi o pomiar długości fragmentów DNA, które są znacznie mniejsze od komórek, mikrobiolodzy potrzebują podstępu, a najwygodniejszą z nich jest elektroforeza żelowa. Ta metoda polega na tym, że fragmenty DNA są naładowane i jest alternatywą dla droższych metody, takie jak krystalografia rentgenowska, która była odpowiedzialna za odkrycie struktury podwójnej helisy DNA.
Jak działa elektroforeza żelowa
Ponieważ cząsteczki DNA są naładowane, oddziałuje na nie prąd elektryczny. Po umieszczeniu ich w neutralnym żelu i umieszczeniu prądu przez żel, cząsteczki migrują w kierunku elektrody dodatniej (anody). Ponieważ cząsteczki DNA o różnych rozmiarach niosą ten sam ładunek, mniejsze poruszają się szybciej, więc ten proces dzieli cząsteczki na pasma, które można porównać z próbkami o znanych rozmiarach.
Podstawowa procedura elektroforezy
Żel jest zwykle wykonany z agarozy, polisacharydu, który po podgrzaniu w roztworze buforowym tworzy półstały, lekko porowaty żel. Na jednym końcu żel tworzy maleńkie wgłębienia zwane studzienkami, w których badacz umieszcza badane próbki DNA wraz z próbkami referencyjnymi o znanej długości, zwanymi drabiną DNA. Długości fragmentów drabiny zostały wstępnie określone inną metodą, taką jak krystalografia rentgenowska.
Po zanurzeniu żelu w roztworze przewodzącym i przyłożeniu napięcia, fragmenty zaczynają migrować przez żel – najpierw mniejsze, a za nimi większe, wolniejsze. W końcu formują się w pasma podobne do widma w zależności od rozmiaru.
Gdy to nastąpi, badacz wyłącza zasilanie, napełnia żel barwnikiem wiążącym DVA i bada próbki w świetle ultrafioletowym. Korzystając z drabiny jako odniesienia, badacz może określić wielkość każdego z fragmentów w widocznym paśmie. Widoczne są tylko prążki – poszczególne fragmenty DNA są zbyt małe, aby je zobaczyć.
Określanie długości nieznanych fragmentów
Szanse nie polegają na tym, że każdy prążek w próbce łączy się z prążkiem na drabinie, więc aby określić rozmiary tych nieznanych fragmentów, naukowcy zwykle sporządzają wykres. Na osi x znajduje się odległość przebyta przez każde pasmo w drabince w milimetrach, natomiast na osi y to rozmiar każdego pasma. Gdy punkty są połączone krzywą, wielkość dowolnego pasma można ekstrapolować z krzywej po zmierzeniu odległości przebytej przez to pasmo w milimetrach.