DNA
Kwas dezoksyrybonukleinowy i białka. DNA jest zorganizowane w jednostki zwane genami, z których każda koduje określoną sekwencję RNA lub białka. Geny są badane w celu poznania struktury i funkcji biologicznej, ewolucji, chorób i wielu innych aspektów systemów żywych. Aby szczegółowo zbadać geny, DNA musi zostać wyizolowane i oczyszczone z komórek będących przedmiotem zainteresowania.
Ekstrakcja DNA
Chociaż DNA z pojedynczej komórki można wydobyć i zbadać, nie wystarczy zobaczyć gołym okiem. Aby uzyskać ilość wystarczającą do buforowania, im więcej komórek musisz pracować, tym lepiej (wiele milionów).
Dokładne protokoły różnią się znacznie, aby uwzględnić unikalne cechy konkretnych próbek, ale ogólne etapy to homogenizacja, liza, trawienie, separacja i zbieranie. Zabieg najlepiej przeprowadzić w małej (w zależności od wielkości próbki) szklanej lub plastikowej probówce.
Próbka jest zazwyczaj mieszana lub mielona, aby dokładnie oddzielić komórki od siebie. To sprawia, że składniki komórki są bardziej dostępne dla kolejnych odczynników. Następnie do homogenatu dodaje się detergent lub enzymy w celu lizy błon komórkowych (i błon jądrowych, jeśli komórki są eukariotyczne) w celu uwolnienia DNA. W tym momencie DNA jest otoczone białkami, lipidami, węglowodanami, wszystkim innym, co było zawarte w komórkach.
Dalsze trawienie enzymatyczne może być konieczne w celu rozbicia białek, aby nie wiązały się z DNA i nie zakłócały jego gromadzenia. DNA oddziela się od pozostałej zawartości komórek przez dodanie zimnego, czystego alkoholu etylowego lub izopropylowego. DNA nie jest rozpuszczalne w tych alkoholach, więc będzie się skondensować, próbując zminimalizować jego kontakt z alkoholem. Następnie zbierano skondensowane DNA, zwykle przez odwirowanie lub spooling.
Buforowanie DNA
Zbieranie DNA przez buforowanie jest skuteczne, gdy w wyniku procedury ekstrakcji uzyskuje się dużą ilość DNA. Jest to również doskonała metoda demonstracyjna, ponieważ wyraźnie widoczna jest imponująca plątanina czystego DNA.
Aby nawinąć DNA, etap rozdziału należy przeprowadzić ostrożnie. Jeśli nie był on częścią wcześniej dodanej mieszaniny odczynników do lizy, stężony roztwór soli (chlorek sodu) należy dodać do roztworu przed etapem dodawania alkoholu. Zimny alkohol powoli wlewa się po ściance probówki, tworząc warstwę na wierzchu roztworu wodnego, unikając mieszania. Jeśli zrobisz to poprawnie, alkohol utworzy własną warstwę na wierzchu słonej warstwy. Potem przychodzi kolejkowanie.
Aby zebrać DNA z warstwy słonej, ostrożnie umieść szklany pręt mieszający przez warstwę alkoholu, aż dotknie dna probówki. Powoli obracaj pręt między palcami, obserwując interfejs między dwiema warstwami. Jeśli obecna jest wystarczająca ilość DNA, zlepi się ono na granicy między warstwami, tworząc mleczno-przezroczystą masę. Obróć pręt, aby owinąć wokół niego DNA (czyli część nawijania) i wyciągnij go z probówki. DNA można przenieść do innej probówki z czystym alkoholem w celu przechowywania lub dalszej analizy.